台湾专利TW201302794A 人類組織因子抗體及其用途

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专利摘要:
本發明是關於一種人類型抗體，其能夠避免組織因子(凝血因子F3)訊息傳遞，但不會防礙對組織因子的因子VII結合和FX結合且不會延長凝血時間。本發明的抗體係用於治療，例如腫瘤進展的症狀，其中相關細胞會表現組織因子且組織因子訊息傳遞發生。
公开号:TW201302794A
申请号:TW101108699
申请日:2012-03-14
公开日:2013-01-16
发明作者:Juan Carlos Almagro；Glenn Mark Anderson；Ellen Chi；Christian Martinez；Gopalan Raghunathan；Ronald Swanson；Alexey Teplyakov；Kam-Fai Tse；Sheng-Jiun Wu；Hong Mimi Zhou
申请人:Janssen Biotech Inc；
IPC主号:A61P1-00

专利说明:
人類組織因子抗體及其用途
本申請案請求2011年3月15日提出之美國專利申請案第61/452,674號的優先權，而前述申請案係完整納入此處以茲參考。
本發明係關於與人類組織因子結合的人類適應性抗體，包含著腫瘤細胞之血管外組織上所存在的一種抗原，而該抗體不會抑制組織因子媒介的血凝結。本發明亦關於使用該抗體來治療諸如相關於人類組織因子之存在與受體功能之癌症情況的方法。
組織因子(TF)，又稱凝血因子III(F3)、組織凝血活酶或CD142，其為具有著一219個胺基酸細胞外區域的一種穿透膜醣蛋白，又該細胞外區域包含2個纖維結合素類型III區域和1個帶有能夠予以磷酸化之絲胺酸殘基、短的細胞內區域。TF是FVII/FVIIa的細胞受體。
TF會以細胞受體形式，在正常腦部、肺部和胎盤內呈現一種較高水平的組織特定分佈，而在脾臟、胸腺、骨骼肌和肝內者則呈現較低水平。亦發現在細胞衍生微粒內，且如同一種選擇性拼接的可溶性形式。除了在正常組織中的表現外，已經報導過TF在多數主要腫瘤類型內與許多腫瘤衍生細胞株內為過度表現(2007年Ruf W發表於J Thromb Haemost期刊5：1584至1587；2009年Milsom等人發表於Aererioscler Thromb Vasc Biol.期刊中29：2005至2014)。
血清蛋白對於受傷而產生凝血是一種對受傷很重要的生理反應。讓血液暴露在包含膠原蛋白(內在途徑)和組織因子(外在途徑)的蛋白質下，會讓血小板和屬於一種凝血因子的血漿蛋白纖維蛋白原開始變化。隨著血管受到損傷，因子VII(FVII)會離開循環路徑，然後發生與組織因子支持細胞(間質成纖維細胞和白血球)上所表現的組織因子(TF)接觸，進而形成一個活化的TF-FVIIa複合體。TF-FVIIa活化因子IX(FIX)和因子X(FX)。FVII係可藉由TF而被異位活化，而藉著凝血酶、FXIa、胞漿素、FXII和FXa而被活化。TF-FVIIa與FXa形成一種三元複合體。
由非血管細胞所表現的組織因子(TF)，藉由活化血凝結而在止血狀況中扮演一個至關重要的角色。TF係進一步涉及與止血不同的進程，且係直接與在細胞表面的功能有關，TF係被表現在該表面上。血管和非血管細胞上之凝血蛋白酶的TF依賴組合活化蛋白酶活化受體(PARs)，該等受體為G蛋白連結受體。因此，TF：VIIa複合體能夠透過PARs來誘導細胞訊息傳遞，該等PARs主要為用於腫瘤形成、血管生成、腫瘤進展和轉移的PAR2(2000年Camerer等人發表於Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：5255至5260：2001年Riewald和Ruf發表於Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：7742至7747；2003年Ruf等人發表於J Thromb Haemost期刊1：1495至4503；2001年Chen等人發表於Thromb Haemost期刊86：334至45)。
三元複合體TF/FVIIa/FXa係藉由作用於FX之TF：VIIa複合體而被直接形成，或在可將FX分裂成FXa、即FIX變成FIXa的TF：VIIa分裂後間接形成。該TF/FVIIa/FXa複合體生成可引起傳遞訊息或活化其他，例如PAR1-4的受體。TF/FVIIa/FXa複合體生成導致介白素-8(IL-8)的誘發，該介白素-8(IL-8)可刺激腫瘤細胞移動(2004年Hjortor等人發表於Blood 103：3029至3037)。PAR1和PAR2兩者係皆涉入腫瘤轉移(2004年Shi等人發表於Mol Cancer Res.期刊2：395至402)，然而活化二元和三元複合體TF-VIIa和TF-VIIa-FXa則是PAR2的活化劑，這也導致細胞訊息傳遞(2005年Rao和Pendurthi發表於Aeterioscler Thromb.Vasc.Biol.期刊25：47至56)。因此有興趣來確定是否組織因子的致癌角色可和前凝血劑角色分開，該前凝血劑角色亦已經長期被懷疑涉及腫瘤移動、外滲和轉移機制。
諸如Morrisey(1988年發表於Thromb Res期刊52(3)：247至261；US5223427)和Magdolen(1996年發表於Biol Chem期刊379：157至165)中所述，對應於組織因子的單株抗體，其係已經用來探索配位基結合位置的功能和免疫觀點。能夠結合組織因子的單株抗體係可，藉由干擾TF以形成或維持TF-VIIa複合體的能力或藉由阻斷複合體以活化FX的能力，而用來阻斷血栓事件。結合組織因子和並不會阻斷凝血的抗體亦為已知。因子VIIa啟動TF訊息傳遞阻斷而非凝血阻斷抗體，例如抗體10H10，亦已經被描述(2006年Ahamed等人發表於Proc Natl Acad Sci USA 103(38)：13932至13937)，且這類抗體已經提供機會來了解在固體型腫瘤中、帶有這類活性之一媒介的角色和用途(2008年Versteeg等人發表於Blood 111(1)：190至199)。Ruf等人在公開申請案WO2007056352A3中揭露在不干擾病人止血下，用來抑制組織因子訊息傳遞的方法和組成。
因為癌症發展是一種多方面進程，所以將會期望有一種屬於TF結合抗體的治療候選物，其能夠封鎖腫瘤細胞上的致癌、轉移、血管生成和抗凋亡功能而同時不干擾病人的止血。
本發明提供一種人類適應性抗人類組織因子特定抗體，供作為保留鼠抗體10H10之結合抗原決定區的人類治療之用，該抗體並不和FVIIa競爭結合組織因子，因此並實質上不阻斷TF-VIIa複合體的前凝血劑、醯胺水解活性，但會阻斷TF-VIIa媒介的訊息傳遞以及下游致癌效應，例如細胞介素IL-8釋放。
本發明的人類適應性抗體係由人類IgG可變區框架構成配合CDR變異殘基，該等CDR變異殘基依照藉由參考10H10鼠抗體CDR序列的序列所判定和依照如序列識別號：6-11和27代表。具FR4而與CDR和CDR變異體結合的人類框架FR1和FR2和FR3係被提供，其許可具鼠抗體10H10免疫特異性之抗體結合域的組合。在本發明一實施例中，以序列識別號：6-11所代表的6個CDR序列，或依照序列識別號：6、8-11和27所代表的群組，係與人類生殖細胞系FRs結合，定義成人類抗體IgG可變區的非CDR位置，選擇以致對人類之TF 10H10的結合親和力係被保留。在一態樣中，人類HC可變區FRs係衍生自如由IMGT資料庫所代表的人類IGHV基因家族1、3或5個成員。在一態樣中，該人類LC可變區FRs係衍生自人類IGKV基因家族2或4個成員。在一實施例中，抗體Fv(與一LC可變區配對的HC可變區)包含選自於序列識別號：12-21的一HC可變區和選自於序列識別號：22-26的一LC可變區。
在一特定實施例中，形成一抗體Fv的人類FRs(與一LC可變區配對的HC可變區)包含IGHV5和IGKV2 FRs。本發明的抗體包含一具有序列識別號：8之H-CDR3的HC可變區；一具有選自於序列識別號：6和62-83之一序列的H-CDR1；一具有選自於序列識別號：7、27和84-107之一序列的H-CDR2；以及一選擇性選自於IGVJ4(序列識別號：60)或其變異體的HC FR4區。本發明的抗體進一步包含那些具有一LC可變區者，該LC可變區具有一L-CDR1；L-CDR2；以及一L-CDR3；以及一選擇性選自於IGKJ2(序列識別號：61)或其變異體的LC FR4區。該L-CDR1具有一選自於序列識別號：9、108-116之一序列；該L-CDR2具有選自於序列識別號：10和117-120之一序列；以及該L-CDR3具有選自於序列識別號：11和121-128之一序列。在一特定實施例中，該人類框架序列係衍生自IGHV5_a，且所產生的可變區包含選自於序列識別號：19、129-155的一序列。在另一實施例中，該人類框架序列係衍生自IGKV2D40_O1，且所產生的可變區包含選自於序列識別號：23、156-163的一序列。
本發明的抗體係可以一種作為具有一結合域、一H-CDR3之抗體的形式而被表示，該結合域係從定義成非CDR位置之IGHV5_a框架所衍生，該H-CDR3具有序列SGYYGNSGFAY(序列識別號：8)，其中在該H-CDR-1位置的序列可以用下列分子式表示：H-CDR1 GYTFX₁X₂X₃WIE (I)(序列識別號：83)其中，X1係選自於A、D、G、I、L、N、P、R、S、T、V和Y；X2係選自於A、P、S和T而X3係選自於F、H和Y；或該序列可為GFTFITYWIA(序列識別號：81)；以及在該H-CDR-2位置的序列可以用下列分子式表示：H-CDR2 DIX₁PGX₂GX₃TX₄ (II)(序列識別號：107)其中，X1係選自於I和L，X2係選自於S和T，X3係選自於A、F、H和w；而X4係選自於D、H、I、L和N；其中H-CDR2為DILPASSSTN(序列識別號：105)的H189中除外。
本發明的抗體用具有一結合域的抗體表示，該結合域係從定義成非CDR位置之IGKV2D40_O1框架所衍生且，其中在該L-CDR-1和/或L-CDR-2以及L-CDR-3的序列具有可以用下列分子式表示的序列：L-CDR1 KSSQSLLX₁X₂X₃ X₄Q X₅NYLT (III)(序列識別號：116)其中，X1係選自於F、P、S、T、W和Y；X2係選自於F、S、T、R和V；X3係選自於A、G、P、S、W、Y和V；X4係選自於G、N和T；和X5係選自於K、R和S；L-CDR2 X₁ASTRX₂S (IV)(序列識別號：120)
其中，X1係選自於H和W；X2係選自於D、E和S；L-CDR3 QNDX₁X₂X₃PX₄T (V)(序列識別號：128)其中，X1係選自於D、F和L；X2係選自於S、T和Y；其中X3係選自於W和Y；而X4係選自於L和M。
因此，該抗體的重鏈和輕鏈CDR殘基係實質上從鼠10H10的CDRs修正而成。例如，根據上述描述得知，該抗體的重鏈可僅有70%(CDR1中有3/10殘基改變過)和60%(CDR2中有4/10殘基改變過)與鼠10H10的CDR類似(CDR3不變)。輕鏈CDR殘基僅有71%(5/17改變過)、(71%)(2/7改變過)或55%(4/9改變過)與鼠10H10的CDR類似。
本發明進一步提供人類適應性抗體，其競爭結合至人類組織因子且因此結合至實質上與在鼠10H10抗體上相同之在人類TF-ECD上的抗原決定區。本發明進一步提供使用此等抗體來治療人類主體的方法，該人類主體罹患一種症狀，其中TF表現以及由該TF表現所產生的局部生物活性係直接或間接與該欲治療的症狀有關。
本發明進一步提供用於製備該等抗體的方法，以及該等抗體之藥學上可接受的製劑、一包含該製劑的容器和一包含該容器的套組，其中本發明的抗體係被製作成適於以治療人類主體之使用的方法。縮寫
TF為組織因子，huTF為人類組織因子，muTF為小鼠組織因子，cynoTF為馬來猴組織因子，TF-FVIIa為組織因子-因子VIIa複合體，TF/FVIIa為組織因子-因子VIIa複合體，HC為重鏈，LC為輕鏈，v-區域為可變區，VH為重鏈可變區，VL為輕鏈可變區，CCD為電荷耦合裝置，CDR為互補決定區，CHES為2-(N-環己胺基)-乙磺酸，EDTA為乙二胺四乙酸，ECD為細胞外區域，HEPES為N-(2-羥乙基)-哌【口+井】-N'-2-乙磺酸，HEK為人類胚胎腎細胞，MES為2-(N-嗎啉)乙磺酸，PAR為蛋白酶活化受體，PBMC為周邊血液單核細胞，PBS磷酸鹽緩衝溶液，PDB為蛋白質資料庫，PEG為聚乙二醇，SDS PAGE為十二烷基硫酸鈉聚丙醯胺凝膠電泳，SEC為粒徑篩析層析法，MAb為單株抗體，FR為框架抗體，HFA為人類框架適應。定義和術語說明
如本文所用，「抗體」包括整個抗體及其任何抗原結合片段或其單鏈。因此，該抗體包括任何含有包含至少一部分免疫球蛋白分子的分子之蛋白質或胜肽，諸如但不被限於，至少一個重鏈或輕鏈的互補決定區(CDR)或其配體結合部分、一重鏈或輕鏈可變區、一重鏈或輕鏈恆定區、一框架(FR)區或其任何部分，或至少一結合蛋白的一部分，其可被併至本發明之抗體。「抗體」一詞係進一步欲含括抗體、其截切片段、特定部分及變異體，包括抗體模擬物，或包含模擬抗體或其特定片段或部分之結構及/或功能的抗體部分，包括單鏈及單鏈域抗體及片段。功能性片段包括對一預選標靶之抗原結合片段。含括抗體之「抗原結合部分」一詞內的結合片段之實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH域所組成之單價(monovalent)片段；(ii)F(ab')2片段，係二價(bivalent)片段，其包含二個藉由位在鉸鏈區(hinge region)的雙硫鍵連結之Fab片段；(iii)Fd片段，由VH及CH域組成；(iv)Fv片段，由抗體單臂之VL及VH域組成；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由一VH域組成；以及(vi)經單離之互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩域、VL和VH係透過不同基因進行編碼，但是它們係可使用重組方法、透過一種合成鏈接物來進行連接，而該合成鏈接物能夠將它們製成一個單一蛋白質鏈，其中VL和VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見如1988年Bird等人發表於Science期刊242：423-426，和1988年Huston等人發表於Proc.Natl.Acad Sci.USA期刊85：5879-5883)。此種單鏈抗體亦欲含括於抗體之「抗原結合部分」一詞內。這些抗體片段係使用具該領域中技術者所知悉的習知技術而獲得，且該些片段係經篩選具有如完整抗體相同方式之效用。反之，scFv建構庫可被使用以篩選抗原結合能力，並接著使用習知技術被剪接為編碼人類生殖細胞系基因序列的其他DNA。此種庫的一個實例為「HuCAL：人類組合抗體庫(人類Combinatorial Antibody Library)」(Knappik,A.等人J Mol Biol(2000)296(1)：57-86)。
「CDR」一詞係指抗體的互補決定區或高可變區胺基酸殘基，其參與或負責抗原結合。人類IgG亞型抗體的高可變區或CDR包含來自輕鏈可變區的殘基24-34(L-CDR1)、50-56(L-CDR2)和89-97(L-CDR3)和來自重鏈可變區的殘基31-35(H-CDR1)、50-65(H-CDR2)和95-102(H-CDR3)等胺基酸殘基，如Kabat等人所述(1991年馬里蘭州貝塞斯達的國家衛生研究院，公衛服務第五版，免疫重要性蛋白質的序列)，和/或來自高可變環的那些殘基(即輕鏈可變區的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區的26-32(H1)、52-56(H2)和95-101(H3)，如1987年Chothia和Lesk發表於J.Mol.Biol.期刊196：901-917中所述)。Chothia和Lesk將結構保守的高可變環稱為「規範結構」。框架或FR1-4殘基則是包圍著高可變區以外的那些可變區殘基。Chothia和Lesk的編號系統藉著顯示在指定殘基處、以小寫符號所表示的延伸、如30a、30b、30c等等，來考慮到環中殘基號碼的差異。更近一些，已經發展出一種通用編碼系統並廣泛採用，稱為國際免疫遺傳學資訊系統®(IMGT)(2005年LaFranc等人發表於Nucl Acids Res.33：D593-D597)。
在此，CDR依據在輕鏈或重鏈內之胺基酸序列及位置兩者、藉由序向編號指稱。由於免疫球蛋白可變區結構內的CDR「位置」在物種間為保留且存於稱為環的結構中，根據結構特徵，藉由比對(align)可變區區域序列使用編號系統，因此即容易辨識CDR及框架殘基。此資訊係用於將來自一物種免疫球蛋白之CDR殘基移接(grafting)及置換至典型上來自人類抗體之受體框架。
如本文中所用的術語「Fc」、「含Fc蛋白質」或「含Fc分子」是指具有至少一免疫球蛋白CH2和CH3域的單體、二聚體或異二聚體蛋白質。CH2和CH3域可形成至少該蛋白質/分子之二聚體區的一部份(如，抗體)。
術語「抗原決定區(epitope)」是指能特定結合至抗體的蛋白質決定因素(determinant)。抗原決定區通常由分子的化學活性表面分類，例如胺基酸或糖側鏈所構成，且通常具有特定三維結構特徵以及比電荷特徵。構形及非構形抗原決定區差別為與前者的結合在變性溶劑存在下即失去，但後者並不會。
如本文中所用，K_D係指解離常數，特定言之，為該抗體對一預定抗原之K_D，且為該抗體對一特定標靶之親和力的量值。高親和力抗體係對一預定抗原具有K_D為10^-8 M或更少，更佳的是10^-9 M或更少，且再佳者為10^-10 M或更少。K_D的倒數為K_A，即締合常數。如文中所用之術語「k_dis」或「k₂」或「k_d」，係意指特定抗體-抗原交互作用的解離速率。「K_D」是解離速率(k₂)(亦稱為「離開速率(k_off)與締合速率(k₁)或「連接速率(k_on)」之比率。因此，K_D等同k₂/k₁或k_off/k_on，且以莫耳濃度(M)表示。K_D越小，則結合越強。因此，K_D為10^-6 M(或1 μM)表示較10^-9 M(或1 nM)結合力弱。
如文中所用之術語「單株抗體」或「單株抗體組成物」係指由單一分子組成之抗體分子的製劑。單株抗體組成物對於一特定抗原決定區呈現單一的結合特異性及親和力。該術語亦包括「重組抗體」及「重組單株抗體」，所有抗體係藉由重組方法製備、表現、產生或單離，例如(a)自動物或融合抗體分泌動物細胞及融合夥伴(fusion partner)融合所製備之融合瘤所單離之抗體；(b)自經轉形以表現抗體之宿主細胞(例如來自轉染瘤(transfectoma))所單離之抗體；(c)自重組株組合人類或其他物種抗體庫單離之抗體；以及(d)藉由任何其他涉及將免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列方式所製備、表現、產生或單離之抗體。如文中所用之「經單離之抗體」，係意指一抗體為實質上不含具有不同抗原特異性的其他抗體。然而一特異性地結合至人類TF之一異構或變異的抗原決定區之經單離之抗體對其他相關的抗原，例如：來自其他物種(如TF物種同源)，可具有交叉反應。此外，經單離之抗體可實質上不含其他細胞材料和/或化學物。在本發明之一實施例中，具有不同特異性之「經單離之」單株抗體的組合係經組合至一明確界定之組成物。
如本文中所用，「特定結合」、「免疫特定結合」及「免疫特異性地結合」意指抗體結合至一預定抗原。典型上，抗體結合具有解離常數(K_D)為10^-7 M或更少，且結合至預定抗原之K_D至少小於其結合非特定抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)K_D二倍。慣用語「會識別抗原的抗體」和「對抗原之特定抗體」係與本文的術語「會特異性地結合抗原的抗體」交替使用。如本文中所用，「高度特定」結合意指特定標靶抗原決定區的抗體之相對K_D至少比抗體結合其他配體K_D的小10倍。
如本文中所用的「同型」意指依照重鏈恆定區基因所編碼的抗體分類(例如IgM或IgG)。一些抗體分類更包含子類，該子類係亦依照重鏈恆定區所編碼，且該子類係又在恆定區域內之特定殘基處(如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)以寡醣裝飾、藉此更將生物功能傳授給抗體。例如，在人類抗體同型IgG1、IgG3和往更低範圍中，IgG2顯示效應物功能就如同鼠IgG2a抗體般。
藉由「效應物」功能或「效應物陽性」係指抗體包含不同於抗原特定結合域之域，能與受體或其他血液成分(例如補體)交互作用，導致例如誘集(recruitment)巨噬細胞，以及導致被抗體之抗原結合域結合之細胞破壞之事件。抗體具有數種藉由結合效應物分子所調介之效應物功能。舉例而言，補體C1成分與抗體結合活化補體系統。補體活化在助噬作用及細胞原體的分解上為重要的。補體活化刺激發炎反應，且亦涉及自體免疫過敏性。再者，抗體經由Fc區結合至細胞，以抗體Fc區之Fc受體位置結合至細胞上的Fc受體(FcR)。有許多的Fc受體，該等受體係對不同種類抗體特定，抗體包括IgG抗體(γ受體)、IgE(η受體)、IgA(α受體)和IgM(μg受體)。抗體結合至細胞表面之Fc受體引發許多重要及多樣之生物反應，包括吞噬及破壞抗體包覆粒子、廓清免疫複合體、藉由殺手細胞抗體包覆之標靶細胞(稱為抗體相依性細胞調介性細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，或ADCC)的分解、釋出發炎調介物、胎盤轉移作用及控制免疫球蛋白產生。
術語「組織因子蛋白質」、「組織因子」和「TF」係用來指稱具有著胺基酸序列的一種多肽，其中該胺基酸序列對應於一種自然產生之人類組織因子或如下所述之重組組織因子。自然產生之TF包含人類及其他動物如兔、大鼠、豬、非人類靈長類動物、馬、鼠、羊的組織因子(例如參見1989年Hartzell等人發表於Mol.Cell.Biol.期刊9：2567-2573；1991年Andrews等人發表於Gene期刊98：265-269，和1991年Takayenik等人發表於Biochem.Biophys.Res.Comm.期刊的181：1145-1150)。該人類組織因子的胺基酸序列係來自UniProt紀錄P13726(序列識別號：1)、馬來猴(序列識別號：2)給予，而鼠的則係來自UniProt P20352(序列識別號：3)。其他哺乳動物組織因子蛋白質的胺基酸序列通常係透過習知技術已知或獲得。
本發明的抗體係用來施予人類主體，或用來接觸想要阻斷因TF訊息傳遞而產生並表現在一種細胞、組織或器官上之人類TF功能的人類組織處，且其中亦期望不會實質上改變因TF：FVIIa複合體形成所產生的TF凝血功能。這類用途係可發現於腫瘤治療上，特別是乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰臟癌和卵巢癌的原發性或次發性固體型腫瘤上。
本發明還包含帶有可與相關領域已知那些序列結合之本發明抗體序列編碼的核酸，以便透過重組手段或將資訊傳遞給環境中的抗體表現而用於建構和生產，而該環境意味想要讓其形成處如培養基、原地和體內。意圖產生本發明抗體而進行這類核酸操作的手段，為熟知本技藝者已知。
本發明更提供諸如藥學上可接受的製劑，或用在本發明經單離形式抗體之給藥和儲存的穩定製劑。 1.抗體的組成特性
本發明係根據一項意外發現，即結合到人類TF、稱為10H10之非凝血阻斷鼠抗體(Edgington等人，美國5,223,427)能夠取消特定細胞內的TF訊息傳遞(2006年Ahmed等人提到上述狀況，WO2007/056352A2)。因此，本發明的抗體為保留鼠抗體10H10的結合抗原決定區之一者，其中該抗體並不和FVIIa競爭結合組織因子，且並實質上不阻斷TF-VIIa複合體的前凝血劑和醯胺水解活性，但會阻斷TF-VIIa媒介的訊息傳遞以及下游致癌效應，例如細胞介素IL-8釋放。本發明的抗體適合於IMGT資料庫中所表示的人類生殖細胞系IgG基因並保留與人類TF的結合，同時人血漿中有鈣存在時不會干擾TF啟動凝血的能力。
保留鼠抗體10H10之結合抗原決定區的一種抗體，其通常可藉由評估該抗體結合到TF的能力以及和10H10對人類TF競爭結合，來進行評估，同時，當存在於一包含在有人血漿的情況下之TF的試樣中之時，與一在沒有該抗體的情況下之人血漿的類似試樣相比，其將實質上並不延長所需用於血漿之TF啟動凝血的時間。在另一種意義上，該抗體的抗原決定區係可使用相關領域已知技術、按照自然法則來進行圖繪，這些技術包含但不限於該抗體所結合之TF的缺失突變、替代突變、限制性水解，接著經由透過胜肽片段識別法和共結晶暨和X光繞射分析法，以便圖繪出TF和該抗體結合域的主要結構的原子結構鄰近區域，藉此定義出該抗體與人類TF間的三維關聯性(圖1)。
因此，該抗原決定區係可定義為與FVIIa結合處非重疊者(圖2和3)。更具體而言，本發明抗體所結合之抗原決定區可與TF的N域(以序列識別號：1所表示的成熟鏈殘基1-104)內、FVII未接觸到的如殘基65-70其中一個以上殘基接觸，而不與C域內者的殘基K165和K166接觸，這種情況對基質結合很重要(2000年Kirchofer等人發表於Thromb Haemostat 84：1072-1081年)，同時人血漿中有鈣存在時不會干擾TF啟動凝血的能力。
在一實施例中，該抗體的結合速率(1/M‧s時的k_a)是大於1×10^-5。在另一實施例中，該抗體針對TF的離開速率(1/s時的k_d)是小於1.0×10^-5，因此產生的K_D是小於1×10^-9 M(小於1 nM)。在一特定實施例中，該抗體是人類生殖細胞系基因適應性抗體，其K_D小於0.5×10^-9 M。在一實施例中，該抗體具有如表11所示、從那些重鏈和輕鏈配對所選出的結合域，諸如M1639、M1645、M1647、M1652、M1641、M1644、M1587、M1604、M1593、M1606、M1584、M1611、M1596、M1601、M1588、M1594、M1607、M1612、M1595、M1599、M1589、M1592、M1583和M1610。
該抗體組成可以進一步稱為包含位在結合域內的胺基酸殘基之一序列，該結合域係選自於可以用序列識別號：6-166表示之一或多個胺基酸序列。具有改變過之Fc功能的抗體變異體
由於使用重組方法所生產之治療性單株抗體用途擴大，因此正在探索這些複合體組成的功能和特性。雖然免疫特定和抗原標靶功能通常在可變區和子域內，諸如高可變區的環端、也稱為CDR，但是該複合體卻會與因恆定域、如IgG的Fc部分所形成之結構所提供的其他受體和血清成份產生交互作用。
抗體和其他含Fc-蛋白質係可藉由幾種著名體外分析來進行功能性比較。特別是，對Fcγ受體之FcγRI、FcγRII和FcγRIII家族成員的親和力有興趣。可採用受體的重組可溶性形式或受體的細胞相關形式來進行這些測量。此外，可採用，例如：重組可溶性FcRn、透過BIA核來測量FcRn的親和力，而FcRn是負責應用於IgG延長循環半衰期的受體。細胞功能分析，例如ADCC分析和CDC分析，提供針對特定變異體結構之可能功能結果的見解。在一實施例中，ADCC分析係配置成以NK細胞為主要效應物細胞，藉此反應出作用在FcγRIII受體上的功能效應。吞噬作用試驗係亦可用來比較不同變異體的免疫效應物功能，如同測量細胞反應，例如超氧化物或炎症調解質釋放的分析。體內模型可應用的情況，還有，例如：使用抗CD3抗體的變異體來測量小鼠的T細胞活化狀況，測量取決於Fc域而結合著特定配位基，例如Fcγ受體的活性。 2.組織因子信號阻斷抗體的產生
具有本申請書內所述之抗體功能和生物活性的抗體，其可包含或衍生自任何哺乳動物，例如但不限於人類、小鼠、兔子、老鼠、囓齒動物、靈長類動物、山羊或其任意組合，且其包含經單離的人類、靈長類動物、囓齒動物、哺乳動物、嵌合體、人類或靈長類動物適應性抗體、免疫球蛋白、其裂解產物和其他特定部分和變異體。單株抗體係可藉由相關領域已知的任何方法、如融合瘤技術(1975年Kohler和Milstein發表於Nature 256：495-497)和相關方法，使用融合到B細胞的不死化融合夥伴來製備。供本發明之用的抗體亦可使用單淋巴細胞抗體法，藉由選殖和表現免疫球蛋白可變區cDNA而被產生，該等免疫球蛋白可變區cDNA係自單淋巴細胞所產生，而該單淋巴細胞係藉由，例如：1996年Babcook,J.等人發表於Proc.Natl.Acad.Sci.USA期刊93(15)：7843-78481；WO92/02551；WO2004/051268和國際專利申請案WO2004/106377所描述的方法而被選出適於特定抗體之製造。
包含著標靶結合域或子域、恆定域和如本文中所用之Fc域的功能非標靶結合域的抗體，其係可以相關領域已知技術的幾種方法來衍生。在一實施態樣中，自然產生抗體域的序列係很方便地從發表過或線上文件或資料庫取得，如V-資料庫(由MRC蛋白質工程中心所提供)、國家生物製品資訊中心(NCBI Ig胚)或由國際免疫遺傳學資訊系統所提供的ImMunoGeneTics®(IMGT)資料庫。人類抗體
本發明還提供結合人類TF的人類免疫球蛋白(或抗體)。這些抗體也可以被特徵化為工程化或適應化。該免疫球蛋白具有實質上來自人類生殖細胞系免疫球蛋白的可變區且包括以之參予抗原辨識的殘基的相關變異，例如Kabat或結構所定義的高可變環的CDRs。恆定區若存在時，亦可實質上為來自人類免疫球蛋白。人類抗體對TF所展現的K_D是至少約10^-6 M(1 mM)、約10^-7 M(100 nM)、10^-9 M(1 nM)或更低。為了影響親和力的變化、例如改善親和力或減低人類抗體對TF的K_D，可進行CDR殘基或其他殘基的替換。
用於結合到TF之人類抗體的製造來源較佳為本文中提供之作為可變區的序列，該等可變區包含一選自於序列識別號：129-163的序列、一選自於序列識別號：28-61之一FR和CDRs，其中，CDRs係選自於序列識別號：6-11、27、62-128之一或多種、使用絲狀噬菌體顆粒上呈現之人類衍生Fab的基因譜來識別為能夠結合人類TF並與馬來猴TF交互作用者。
將任何非人類的CDR取代到任何人類的可變區FR內，可能無法讓對應於CDR起源處之母代可變FR的結構間仍形成相同空間方位。欲配對於最終Mab的重鏈與輕鏈可變框架區可衍生自相同或不同的人類抗體序列。該人類抗體序列可為天然發生的人類抗體的序列，可為衍生自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列的序列，或可為數種人類抗體及/或生殖細胞系序列的共有序列。
合適的人類抗體序列係經由電腦比較小鼠可變區的胺基酸序列與已知人類抗體的序列而加以鑑定。比較係分別對重鏈與輕鏈進行但原則為彼此類似。
關於經驗方法，已發現特別便利地為創造可用於篩選所欲多樣性、結合親和力或特異性的變異體序列庫。一種用於創造該等變異體庫的格式為噬菌體顯示載體。又，變異體係可使用為了將核酸序列之雜色編碼至可變區內之標靶殘基的其他方法來產生。
決定是否需要進一步取代的另一方法，以及用於取代的胺基酸殘基的選擇，可使用電腦模型完成。用於製造免疫球蛋白分子的三維影像的電腦硬體與軟體已可廣為取得。一般而言，分子模型係由經解析的免疫球蛋白鏈或其域的結構開始產生。欲模型化的鏈是與相似於經解析的三維結構的鏈或域的胺基酸序列比較，以及選擇顯示最大相似性的鏈或域作為構築該分子模型的起點。經解析的起始結構係修正以使介於免疫球蛋白鏈或域之真實胺基酸之間的差異被模型化，且其等於起始結構中。然後經修正的結構被組裝為組合免疫球蛋白。最終地，該模型藉由能量模擬以及藉由確認所有原子皆彼此相距於適當距離內且結合長度與角度皆於化學可接受限制內而被精細化。
由於編碼的簡併，核酸序列的變異性將編碼各免疫球蛋白胺基酸序列。期望的核酸序列係可藉由de novo(重新)固相DNA合成，或藉由期望之多核苷酸早期製備成之變異體的PCR突變來產生。編碼本發明所揭示的抗體的所有核酸皆涵括於本發明。
如本文所述而製造得人類抗體的可變區段典型地係連結至人類抗體恆定區的至少一部份。該抗體將含有輕鏈與重鏈恆定區兩者。重鏈恆定區通常包括CH1域、鉸鏈域、CH2域、CH3域，以及有時的CH4域。
人類抗體可包含來自任何抗體種類的任何類型的恆定域，抗體種類包括IgM、IgG、IgD、IgA與IgE，以及任何亞種類(同型)，包括IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4。當期望人類抗體顯現細胞毒性活性時，恆定域通常為補體-固定恆定域且該種類典型為IgG₁。當不期望該等細胞毒性活性時，該恆定域可為IgG₂種類。人源化抗體可包括來自多於一種的種類或同型的序列。
視需要連結至恆定區的編碼人類輕鏈與重鏈可變區的核酸，可插入至表現載體。輕鏈與重鏈可選殖於相同或不同的表現載體。編碼免疫球蛋白的DNA區段可操作地連結至表現載體的調控序列以確保免疫球蛋白多肽的表現。該等調控序列包括信號序列、啟動子、增強子以及轉錄終止序列(參照1998年Queen等人發表於Proc.Natl.Acad.Sci.USA期刊86，10029；WO90/07861；1992年Co等人發表於J.Immunol.期刊148，1149，皆納入本文之中以完整參考其所有目的)。
抗體或Fc、或其組成和域及其亦可從這類域或組成資料庫，如噬菌體資料庫中選得。噬菌體資料庫係可藉由插入隨機寡核苷酸資料庫或含有，例如來自於免疫動物或人類之B細胞，受到關注之序列的多核苷酸資料庫所產生(2000年Hoogenboom等人發表於Immunol.Today 21(8)371-8)。抗體噬菌體資料庫包含位在一噬菌體內的重(H)和輕(L)鏈可變區配對，能夠讓單Fv片段或Fab片段表現(2000年Hoogenboom等人發表於supra)。噬菌體資料庫的差異係可加以調節，以增加和/或改變資料庫之單株抗體的免疫特異性，進而產生出額外、所期望的人類單株抗體並進行之後的識別。例如：重(L)鏈和輕鏈(L)免疫球蛋白分子的編碼基因係可進行隨機混合(改組)，以便在組合過免疫球蛋白分子中創造出新的HL配對。此外，H和L鏈編碼基因任一或兩者係可在免疫球蛋白胜肽可變區的互補決定區(CDR)內進行誘變，之後針對想要的親和性和中和能力進行篩選。抗體資料庫也係可藉由選出一個以上人類FR序列、然後導入人類抗體基因譜所衍生之CDR閘集合或穿過設計後之變異體而綜合產生(2000年Kretzschmar和von Ruden發表於Current Opinion in Biotechnology 13：598-602)。差異的位置並不受限於CDR，但也可包含可變區的FR段或可包含不是抗體可變區，例如胜肽。
可包含除抗體可變區以外之其他標靶結合或非標靶結合組成的其他資料庫，為核糖體呈現、酵母呈現和細菌呈現。核糖體呈現是一種將mRNA轉譯到其同源蛋白質內的方法，同時讓蛋白質維持在附著到RNA症狀下。核酸編碼序列係由RT-PCR回收(1994年Mattheakis,L.C.等人發表於Proc.Natl.Acad.Sci.USA期刊91，9022)。酵母呈現係以膜相關之α-凝集素酵母黏著受體、交配型系統一部分之aga1和aga2的融合蛋白質結構為基礎(1997年Broder等人發表於Nature Biotechnology 15：553-7)。而細菌呈現則係以標靶對細胞膜或細胞壁相關之輸出細菌蛋白質的融合為基礎(2002年Chen和Georgiou發表於Biotechnol Bioeng.79：496-503)。
本發明還提供本發明之核酸編碼組成來作為經單離的多核苷酸，或作為包含著與原核、真核細胞或絲狀噬菌體表現、分泌和/或該組成或其應用之誘變呈現相容載體的表現載體部分。 3.本發明抗體的產生方法
一旦已經根據本文中所述之結構和功能特徵而識別出本發明的抗體分子時，核酸序列編碼其想要的部分或整個抗體鏈係可進行選殖、複製或化學合成，且係可予以單離並用來藉由常規方法以表現抗體。本發明抗體的純化，係可藉由適於免疫球蛋白分子純化的任何相關領域已知方法來進行，例如藉由層析(如離子交換、親和性和分子篩層析法)、離心、差別性溶解度，或藉由適於蛋白質純化的任何其他標準技術來進行。此外，本發明的抗體或其片段，係可融合到本文內所述或相關領域已知其他的異源胜肽序列，以促進純化。宿主細胞選擇或宿主細胞加工
如本文所述，針對重組含Fc蛋白質或單株抗體表現所選出的宿主細胞，對於最終組成是一個重要的貢獻者，該最終組成包含但不限於裝飾免疫球蛋白CH2域內之蛋白質的寡醣部分組成中的變化。因此，本發明的一實施態樣包含選出適於表現想要的治療蛋白質之生產細胞使用和/或開發的宿主細胞。
此外，該宿主細胞可為哺乳動物起源，或可選自於COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆蟲或植物細胞，或其任何衍生、凋亡或轉化細胞。
另外，該宿主細胞係可選自於不能夠糖化胜肽的物種或有機體，如天然或加工過之大腸桿菌屬、克雷伯菌屬或假單胞菌的原核細胞或有機體。 4.抗TF抗體的使用方法
藉由上述方法任一者所產生的組成(抗體、抗體變異體或片段)，係可用來診斷、治療、檢測或調節細胞、組織、器官、體液或通常是宿主內的人類疾病或特定病症。如本文中所教示的，在標靶結合後，一抗體的Fc部分、Fc融合蛋白質或Fc片段的修飾以提供效應物功能之更準確地適用範圍，但其中抗體保留原來的標靶特性，將產生出適於特定應用和治療適應症的抗體變異體。
可使用本發明所提供的一組成而被適用於治療的疾病或病狀包括，但不被限於：癌症；該癌症包括原發性固體型腫瘤和轉移癌；癌、腺癌、黑色素瘤、諸如，淋巴瘤、白血病和骨髓瘤之液體型腫瘤和隨著癌症發展的入侵性塊狀；軟組織癌；肉瘤、骨肉瘤、胸腺瘤、淋巴肉瘤、纖維肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪瘤、神經膠母細胞瘤、星細胞肉瘤、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、膽道癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、肺癌、腎臟癌或膀胱癌。
迄今為止因為本發明的抗體會藉由阻斷TF參與下游細胞介素，例如炎症細胞介素、IL-8等釋放的能力而降低組織內前致癌環境，故本發明的抗體係當作預防性使用、或結合針對抑制腫瘤細胞增殖和血管生成的其他治療使用。多數與年齡有關的癌症衍生自可再生組織的上皮細胞。上皮組織的一項重要元素是間質，細胞外基質和包含成纖維細胞、巨噬細胞和血管內皮細胞等數種類型細胞所構成的上皮下層。在癌腫瘤中，間質是腫瘤生長和發展的關鍵，而TF係可表現在間質細胞、還有癌上皮細胞上。因此，存在的TF導致下游因素，間質中TF：VIIa訊息傳遞所導致下游因子存在，可能會創造出協同致癌突變的前致癌組織環境，而驅使腫瘤組織的形成。
同樣，當TF係表現在脂肪組織中時，其可修改諸如肥胖、代謝併發症狀和糖尿病等症狀中的組織功能。本發明的抗體可藉由阻斷TF：VIIa訊息傳遞而用於這些症狀的治療。下游TF：VIIa訊息傳遞所產生的一些因子，包含IL-8和IL-6，屬於強力的炎症調節劑。本發明抗體的其他用途因此包含炎症症狀的治療，例如但不限於風濕性關節炎、發炎性腸疾和氣喘。
由於本發明的抗體會抑制TF：VIIa訊息傳遞並減少下游促進血管新生的效應，故本發明的抗體可用於癌症以外，涉及血管生成之其他疾病、失調和/或症狀的治療。這些疾病、失調和/或症狀包含，但不被限於：良性瘤，例如：血管瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、砂眼、化膿性肉芽腫；動脈硬化斑；眼部血管新生疾病，例如：糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變、黃斑點退化、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼、晶體體後纖維組織增生、虹膜發紅、視網膜母細胞瘤、眼睛的眼色素層炎和翼狀贅肉(異常血管生長)；風濕性關節炎；牛皮癬；傷口癒合延遲；子宮內膜異位；脈管發生；肉芽；肥厚性疤痕(瘢痕瘤)；未癒合性骨折；硬皮病；砂眼；血管附著；心肌血管生成；冠狀動脈側枝；腦絡；動靜脈畸形；缺血性肢體血管新生；遺傳性出血性血管擴張症；斑部新生血管；微血管擴張症；血友病性關節；血管纖維瘤；纖維肌肉發育不良；傷口肉芽；克隆氏症和動脈粥狀硬化。
迄今為止因為本發明的抗體會抑制TF：VIIa訊息傳遞，故該抗體係可用來治療和/或診斷包含但不限於腫瘤的過度增生性疾病、失調和/或症狀。該抗體能夠抑制失調通過直接或間接的相互作用而擴散。可藉由本發明的抗體進行治療和/或診斷的過度增生性疾病、失調和/或症狀的實例，包括，但不被限於，高γ-球蛋白血症、諸如卡斯特雷曼氏症的淋巴組織增生性疾病、失調和/或症狀、異型蛋白血症、紫癜病、類肉瘤病、Sezary症候群、華登特倫氏巨大球蛋白血症、高雪氏症、組織細胞增生症以及其他任何身體器官、組織或液體艙的過度增生疾病。
本發明抗體可用於治療的其他方式包括，但不限被於，該抗體的直接細胞毒性、例如藉由補體(CDC)或效應物細胞(ADCC)所調解時，或該抗體的間接細胞毒性、如免疫連接物時。
雖然已經籠統描述過本發明，本發明實施例將更揭露以下實例，但實例不應視為專利申請範圍的限制用。在實驗描述中，某些試劑和步驟係用來製造蛋白質或抗體或指定片段。例行用來表徵該抗體的分析方法如下所述。材料和方法蛋白質和抗體的標準
人類TF的重組細胞外區域(ECD)係建構成兩種形式：為了ELISA和Biacore基礎直接結合分析，故TF成熟鏈(如序列識別號：1)的胺基酸1-219係以一C端His6-標示肽方式表現在哺乳動物系統中；為了共晶體學研究，故序列識別號：1的胺基酸5-213係以一C端His6-標示肽方式表現在細菌系統中。人類_TF1-219係蛋白質上的NHS酯化學標靶胺殘基來進行生物素化。為了凝血檢定，故使用Innovin®(Dade Behring公司分類編號B4212)，其為結合診斷用之磷脂、鈣、緩衝液和穩定劑的一種凍乾的重組人類組織因子。
馬來猴(cyno)TF-ECD(序列識別號：2)係使用PCR技術、從BioChain研究所(加州海沃德)所獲得之cDNA經單離形式之馬來測試組織來進行選殖。
幾種抗體係用來當作參考抗體：i)從原始融合瘤TF9.10H10-3.2.2(美國7223427)所選殖的10H10；ii)一10H10小鼠-人類嵌合體，包含帶有人類IgG1/Kappa恆定區、特指為M1的序列識別號：4和序列識別號：5；iii)M59，一人類FR適應性抗體，包含10H10的6個CDR且當作適於親和力成熟的母帶抗體，包含帶有人類IgG1和人類Kappa恆定區的序列識別號：19和序列識別號：23；iv)鼠抗人類組織因子抗體TF8-5G9(US 7223427)；v)來自於抗體5G9、人類化者，稱之為CNTO 860，當作人類IgG1/Kappa(US7605235)；和vi)同型對照(人類IgG1/kappa)抗體，結合到稱為B37的不相干抗原(RSV)者。抗體的表現和純化
使用例行步驟來進行所揭露之抗體的表現和純化。就初步篩選而言，DNA對這些分子進行編碼，係瞬間在96孔盤內的HEK 293E細胞內表現，然後在轉染後96小時對上清液進行活性測試(結合)。確定命中者，接著讓其進行實驗性規模表現和純化。實驗性規模表現係瞬間即在750毫升體積的HEK 293F細胞或CHO-S內完成。讓收穫之上清液透過蛋白質A層析法進行純化，接著針對純化後之蛋白質進行其親和性和功能活性評估。此外，讓純化後之蛋白質受到藉由SDS-PAGE、SE-HPLC和交互作用層析法(CIC)的生物物理特性化。同時計算出每個變異體的理論等電點(pI)。自實驗性規模特性化，一系列最終重要的候選者在WAVE生物反應器內進行轉染，然後透過蛋白質A進行純化。 Fab的生產和單株Fab ELISA
從噬菌體篩選回合所得的甘油菌係進行少量萃取，而pIX基因係以NheI/SPEI消化予以摘除。重新接合後，讓DNA在LB/瓊脂板上過夜，以轉化成TG-1細胞然後生長。第二天，撿出菌落、過夜生長，然後將培養基用在(i)菌落PCR和V-區域測序，及(ii)Fab的生產誘發。為了Fab的生產，故在新的介質中將過夜的培養基稀釋成10至100倍，然後在攝氏37度下生長5至6小時。Fab的生產係受到的添加含有IPTG的新鮮介質而誘導，然後讓培養基在攝氏30度下過夜進行生長。第二天，讓培養基短暫離心，接著將含可溶性Fab蛋白質的上清液用在ELISA。
為了Fab ELISA，故藉由多株抗-Fd(CH1)抗體而將Fab抓到板上。經過適當清洗和阻斷後，添加濃度為0.2 nM的生物素化hTF。這種濃度能夠讓Fab變異體排序、依照母代的結合百分比而定，其中出現在所有板中當作對照組的母代Fab係定義成百分百結合。該生物素化hTF係利用HRP共軛鏈黴抗生物素蛋白和板讀出器之化學發光讀值來進行偵測。 TF-ECD結合Mab基底ELISA
使用化學發光偵測的一種溶液相直接TF結合ELISA，係用來針對來自人類框架適應性資料庫上面的結合劑進行排序。96孔黑色酶標反應板係在4℃下，塗佈著100微升，以pH9.4之碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液稀釋成4微克/毫升的山羊抗人類IgG Fc隔夜，然後以清洗緩衝液(帶有0.05%Tween-20(商品名，聚山梨醇酐酯月桂酸酯20)的PBS溶液)清洗3次，且以300微升、1% BSA/10 mM PBS溶液而被阻斷歷經1小時，接著如前所述被清洗。讓試樣或標準品在分析緩衝液(1% BSA溶於PBS內+0.05% Tween)稀釋成50奈克/毫升，接著在室溫下將100微升將入分析板內振盪1小時。將該板清洗3次，將100微升以分析緩衝液稀釋成100奈克/毫升、帶有His標記的人類或馬來猴TF-ECD添加到每板中，接著在室溫下培育2小時。清洗後，將100微升、以分析緩衝液1：2000方式稀釋的Qiagen過氧化氫酶共軛Penta-His添加到每板中，接著在室溫下振盪培育1小時。然後以緩衝液1：100方式稀釋來製作新鮮的BM化學發光基質(羅氏POD的BM Chemilum)，在最後一次清洗後將100微升加入板內。10分鐘後，以BM ChemiLum程式在Perkin Elmer公司Envision Reader讀出器上讀取該板。藉由FACS之抗組織因子mAb的MDA-MB-231整體細胞結合
這項分析係用來偵測抗體對乳腺癌細胞中所表現之內源人類TF的直接結合。準備溶於FACS緩衝液(1% FBS溶於PBS中)4點滴定的測試mAb，一式兩份。開始以1：4稀釋進行1000奈克/毫升時的滴定。母代分子M1係當作陽性對照組，而抗RSV mAb、B37係當作陰性負/同型對照組。在FACS緩衝液1：200內，未染色細胞和二次抗體、Cy-5共軛羊抗人類IgG Fc抗體係當作對照組，並在使用前立即製備。
使用標準組織培養技術，以PBS(不含Ca+2/Mg+2)沖洗培養瓶中所附著的MDA-MB-231細胞一次。以Versene舉起細胞並計算細胞數量，然後將200,000個細胞種在聚苯乙烯V型底板中的每個板內。FACS分析協定：組織因子結合。沉澱在4℃下，以450×g離心3分鐘讓Allegra X-15R中的細胞，再懸浮於緩衝液FACS中(2% FBS溶於PBS中)，然後將200微升內的200,000個細胞舖每個板上。沉澱物細胞在4℃下，以450×g離心3分鐘。丟棄上清液，每板添加100微升測試或對照組mAb到指定板內，然後在冰上或4℃下培育1小時(+/-10分鐘)。沉澱物細胞在4℃下，以450×g離心3分鐘。丟棄上清液並以FACS緩衝液清洗細胞一次。再懸浮細胞於每板200微升FACS緩衝液中，且沉澱物細胞在4℃下，以450×g離心3分鐘。丟棄上清液，每板添加100微升二次抗體到指定板內(滴定)，然後在冰上培育1小時(+/-10分鐘)。沉澱物細胞在4℃下，以450×g離心3分鐘。丟棄上清液並先以FACS緩衝液清洗細胞2次，然後再懸浮細胞於每板200微升FACS緩衝液中(滴定)。沉澱物細胞在4℃下，以450×g離心3分鐘。丟棄上清液，且再懸浮細胞於每板100微升CytoFix緩衝液中。藉由流式細胞儀(BD FACSArray)來分析反應。FlowJo軟體係藉由找出未染色之對照組板中的主要細胞分佈，並將該途徑應用到整個數據集合中，而進行FACS數據分析。該數據係導出為所應用途徑紅色通道內的一個幾何平均螢光強度(MFI)圖表。 Thermofluor分析
Thermofluor技術是在分子受到加熱時，針對該分子的反摺疊情況進行動力測量。一旦分子受到加熱時，染料(ANS)即能夠結合到呈反摺疊的分子。一旦該染料結合到分子將會發出螢光，然後測量隨時間變化的螢光。在這項分析中，是測量在37至95℃下的抗體反摺疊，且每0.5℃時偵測。亦在Tm值已知的2種mAb當作分析對照組(Emmp 4A5和Emmp 5F6)下，測量鼠和嵌合體(10H10、M1、5G9和CNTO860)兩者中母代分子的Tm值。
這項分析係用來預測人類框架適應性資料庫變異體的熱穩定性。將純化後的抗體稀釋成溶於PBS，濃度為0.5毫克/毫升，然後取2微升試樣到各孔，即每孔為1微克試樣。每試樣添加為一式兩份。庫存ANS為溶於DMSO，濃度500 mM。以1：12、用DMSO來稀釋庫存ANS(40 mM)；藉由結合20微升的40 mM ANS溶液，2.8微升，10%Tween和1.98毫升PBS來製作染料/Tween溶液；添加2微升染料/Tween溶液和2微升油。為板進行離心(450 rpm，2分鐘)。Thermofluor設定：快門設定為手動，斜坡溫度0.5 C/秒，連續斜坡，溫度斜坡：50至95℃。選擇在高溫時維持15秒，曝光時間10秒/1回合，獲得正常=2，選擇「單SC圖片/板」。交互作用層析法(CID)
為了判定各種抗體與其他人類抗體的相互作用，故採用一與人類IgG結合的管柱(Sigma Aldrich公司)來進行層析法實驗。簡言之，遵照製造商指示將50 mgs的人類IgG同1毫升NHS-Sepharose管柱(GE醫療)結合。以0.1 M Tris、pH8、0.5 M NaCl清洗以去除掉未結合的IgG，並用相同緩衝液來阻斷未反應的NHS官能基。使用Pierce的Coomassie Plus Assay Kit(Thermo Pierce)來測量未反應的結合緩衝液和清洗液中殘留的蛋白質濃度、減去固定前的蛋白質量，藉此判定結合效率。亦準備一個對照組管柱，使用相同協定，但未添加蛋白質到樹脂內。
對照組管柱以PBS、pH7、流速0.1毫升/分鐘下平衡後，在Dionex UltiMate 3000 HPLC上第一次運行。首先注射20升的儲備蛋白質溶液，以確保阻斷非特定結合位置，接著以20升的10%丙酮來檢查該管柱的完整性。
將欲分析的試樣稀釋成溶於PBS、pH7、0.1毫克/毫升。將每個試樣各20微升注射到每根管柱上，然後讓它在流速0.1毫升/分鐘下運行30分鐘。記錄滯留時間，然後計算出各變異體的滯留因子(K')。
K'的計算值為蛋白質衍生管柱(IgG組合管柱)上之滯留時間t_R和無蛋白質結合的管柱上之滯留時間t₀，兩者之間的差。計算值亦將丙酮在兩管柱上的滯留時間列入考慮，以便讓管柱標準化。K'可接受值為小於0.3。溶解度
為了判定各種抗體在室溫下的溶解度，故使用離心過濾設備來進行濃度實驗。簡言之，在室溫下，於PBS中的抗體製劑被添加到Vivaspin-15(15毫升)離心過濾器裝置(德國哥廷根的Sartorius 30,000 MWCO)。使用旋臂式轉子讓過濾液在Beckman Allegra X15-R離心機內以3000×g旋轉20分鐘間隔。一旦體積降低到約2毫升時，將上清液轉移到Vivaspin-4(4毫升)過濾設備(30,000 MWCO)，然後以4,000×g離心20分鐘間隔。一旦體積降低500升，將試樣轉移到Vivaspin-500升過濾裝置，然後在Eppendorf 5424離心機內以15,000×g離心15分鐘。這樣重複直到蛋白質濃度達到100毫克/毫升以上。以適當稀釋在BioTek SynergyHT TM光譜儀上、280奈米和310奈米的吸收來判定蛋白質濃度。在這點時，停止離心使試樣在室溫下過夜以達到平衡。第二天早上，檢查該試樣是否有析出跡象。如果濃度大於100毫克/毫升，則停止該製程。 VIIa因子-誘導的IL-8抑制作用分析
這項分析係用來測試TF結合抗體是否會中和掉來自人類細胞表現TF時的FVIIa-誘導IL-8釋放。適合於DMEM和10% FBS(GIBCO：分類編號11995和分類編號16140)中生長的人類乳腺癌細胞(MDA-MB-231)(ATCC HTB-26)，係使用標準細胞培養技術，以每孔20000個細胞(10萬個細胞/毫升)的密度舖在96孔細胞培養板(NUNC：分類編號167008)上。讓細胞先恢復2天，然後開始抗體治療，以2ug/毫升進行1：2或1：4的連續稀釋在不含FBS的DMEM中。在利用FVIIa(創新研究：分類編號IHFVIIa，批號：2824)治療開始前一小時，先添加抗體，使其在不含FBS的DMEM中最終濃度為50 nm。將細胞放置在培育器內24小時。治療後，收集上清液，然後根據製造商協定以ELISA來偵測IL-8數量(R&D Systems：分類編號D8000C)。簡言之，在450奈米和540奈米處讀取各個治療試樣的光密度值(OD)。540奈米處的讀數係用來校正分析版中的光學缺陷，而450奈米處，修正後讀值(OD 450減去OD 540)則係用來根據製造商協定所備妥之IL-8標準曲線來計算出治療試樣中的IL-8含量。帶有細胞但未接受抗體和FVIIs治療的孔係用來定義內源性IL-8水平，而帶有細胞但僅接受FVIIa的孔則係用來定義「沒有抑制作用」的IL-8水平，藉此分別定義出最低和最高的IL-8水平。將mAb滴定治療試樣係依照上述定義的最大和最小IL-8水平且依照抑制作用百分比所表現來正規化。正規化後的數據係以長條圖表示，或搭配到符合萃取EC₅₀值對應於各個mAb的4種參數邏輯曲線。凝血檢定
這檢定係用來在判定人血漿中有鈣和重組人類TF製劑(Dade Behring公司的Innovin)存在時，抗人類TF抗體是否會阻斷體外的凝血。將抗-人類TF抗體稀釋成溶於HBSS中、2毫克/毫升的抗體(Gibco，分類編號14175)。將帶有檸檬酸鈉的匯集人血漿(密西根州Novi的George King Biomedical)以1000 rpm旋轉沉澱5分鐘，然後將清澈的血漿轉移到一個新的試管。在一個乾淨的96孔分析板(NUNC，分類編號439454)各孔中，將25微升稀釋過的抗體添加到100微升的人血漿內。將125微升，以1：500稀釋到含有22 mM氯化鈣之HBSS中的Innovin(Dade Behring公司，分類編號B4212)添加到含有帶著或不帶著抗體的血漿之各孔內，即讓反應開始。緊接著在反應開始後，在37℃下，使用SpectraMax M2E讀出器(加州桑尼維爾的Molecular Devices)在OD 405處動力監控凝血反應30分鐘。使用Softmax Pro軟體來判定各個抗體的T½ Max，即當達到最大光密度50%時所需的秒數。將適於試樣所需秒數的時間正規化為各板上的參考值，然而統計上適於不含抗體的試樣，適於10H10和適於所有10H10衍生和人類適應性變異體的平均時間，即試樣介於150秒至200秒間並沒有差異。實例1：10H10的序列
位在加州拉霍亞的斯克里普斯研究所所產生，稱為10H10的鼠抗體(US5223427，1998年Morrisey等人發表於Thromb Res.期刊52(3)：247-261)係由融合瘤TF9.10H10-3.2.2所產生。來自10H10融合瘤殖株的抗體序列過去未曾報導過。
該等序列係使用5'RACE方法(2003年發表於Focus期刊25(2)：25-27；1994年Maruyama發表於Gene期刊138，171-174)來識別，其中，兩抗體鏈VH和VL係使用分別對位在小鼠IgG1恆定區和小鼠Kappa恆定區內之一序列互補的5'GeneRacer^TM(InVitrogen)引子和3'共有引子而被放大。使用5'GeneRacer巢狀引子和3'共有引子所進行的巢式PCR放大，係用來產生更適合序列分析的VL產物。
選出至少16個殖株來進行各鏈可變區的識別。引子係用來經由插入物未知區間定序。將原始序列數據從ABI DNA Sequencer下載到Vector NTI(Invitrogen Informax)來進行序列分析。識別出一個功能VH和一個功能VL。進一步分析VH和VL基因二者，以便找出其等之天然訊息序列、FR、CDR和J段。
將除了VH之CDR-1相對應區域以外的10H10 FR和CDR依序編號，並依照Kabat定義來分段(1991年Kabat等人發表於華府國家衛生研究院公衛服務第五版中)。就這個區域來說，結合Kabat和Chothia定義來使用(Raghunathan,G.發表於US2009/0118127 A1；1987年Chothia和Lesk發表於J Mol Biol期刊196 J(4)：901-17)。
選殖的V區係以人類IgG1/Kappa恆定區來進行工程，並選殖到適於HEK293和CHO細胞株內之重組表現的哺乳動物表現載體中，該等細胞株創造出應用在分析開發中當作參考抗體的一特指為M1之之小鼠-人類嵌合抗體。HC的V-區亦係僅以人類IgG1 CH1域和C-末端6個組胺酸來進行工程，以便產生出晶體結構分析中所使用的10H10Fab。實例2：非抗凝劑組織因子抗體的抗原決定區圖譜比對
針對10H10的抗原決定區圖譜比對，係藉由人類TF ECD和相對應之Fab片段間複合體的晶體結構測定而實施。His-標記人類TF ECD(序列識別號：1的殘基5-213)係表現在大腸桿菌中，並分別使用一HisTrap HP管柱(GE醫療)和一個Q HP管柱(GE醫療)進行親和力和離子交換層析法而予以純化。10H10 Fab的His-標記嵌合版本(小鼠V區、人類恆定域)係表現在HEK細胞中，並使用親和性(GE醫療的TALON管柱)和分子篩(GE醫療的HiLoad Superdex 200管柱)層析法予以純化。
藉由以莫耳比例1：1.2(過量TF)方式混合Fab和人類TF ECD，以製備複合體。讓混合物在室溫下培育20分鐘，然後裝載到以20 mM HEPES、pH 7.5和0.1 M氯化鈉平衡過的Superdex 200管柱(GE醫療)上。收集主要波峰對應的餾份，濃縮成10毫克/毫升，然後作為結晶之用。該複合體係利用20℃下的蒸氣擴散法來進行結晶化。讓10H10：TF複合體從含有溶於0.1 M CHES、18% PEG 8000、pH 9.5溶液中結晶化。為了X光數據收集，故將複合體晶體浸泡在補充有20%甘油的母液中幾秒鐘，然後在100K的氮氣流體下瞬間冷凍。X光繞射強度係使用配備Saturn 944 CCD偵測器和X-STREAM^TM 2000冷凍冷卻系統(Rigaku)的Rigaku MicroMaxTM-007HF微聚X光產生器進行測量。該結構係使用適於大分子晶體學程式的CCP4套件，藉由分子置換來判定(1994年，Collaborative Computational Project，第4號Acta Cryst.D50，760-763)。
該TF ECD是由帶有免疫球蛋白折疊的兩種拓撲結構相同域構成。N-端域延伸到殘基1-103，C-端域延伸到殘基104-210(屬於ECD的，序列識別號：1)。發現10H10抗原決定區是位在ECD之殘基K149-D150的中央，達到10H10重鏈和輕鏈可變區間的深處小塊區域。10H10和TF間界面非常廣泛，包含所有6個CDR循環(圖1)。
值得注意的發現是，10H10的TF抗原決定區並不會與FVII和FX(圖2和3)結合位置重疊。此外，10H10和5G9的抗原決定區(能夠阻斷凝血的另一鼠人類-TF結合抗體，且抗原決定區係先前1998年Huang等人發表於J Mol Biol期刊275：873-94)確實部分重疊，解釋了這兩種抗體間對人類TF的競爭性結合(圖2和3)。人類TF ECD：10H10界面
10H10結合TF的位置在ECD的N-和C-端域間之界面處。TF的凸面符合抗體CDR的凹面。因複合體生成而埋沒的總面積超過各交界分子上的1,100Å2。所有6個CDR係涉及與TF的直接接觸(接觸定義為4-A原子間距離)。總共有24個抗原決定區殘基和25個抗體結合部位殘基。CDR的L1、H1和H3形成接觸的主要部份。形成10H10：TF複合體之抗原決定區和抗體結合部位的殘基如圖1示意般。
10H10抗原決定區包含來自TF ECD之N-域的2個片段和來自C-域的3個片段。來自N-域的2個片段會與抗體相互作用：殘基65-70與H-CDR1和H-CDR3相互作用，而殘基104與H-CDR1相互作用。C-域中的3個片段會與抗體相互作用：殘基195和197與H-CDR1和H-CDR2相互作用，殘基171-174與L-CDR1和L-CDR3相互作用，殘基129-150與L-CDR1、L-CDR3、H-CDR1和H-CDR3相互作用；TF殘基K149-D150是位在抗原決定區中央；達到VL和VH域間所形成的深處小塊區域，其中他們主要合作對象分別為10H10之LC可變區的D97(序列識別號：5)和HC可變區的W33(序列識別號：4)。 B.抗體特異性
人類、馬來(cyno)猴(序列識別號：2)和小鼠TF ECD(序列識別號：3)的胺基酸序列係排列在圖2中。人類和馬來猴TF ECD的序列間有高度相似性，兩者只有一個殘基不同、位在10H10接觸殘基：序列識別號：1的位置197，其為馬來猴序列中的R(Arg)。一旦人類序列中的T197接觸到一單一H-CDR2殘基時，就可以解釋目前10H10源性抗體組的高度交互反應性。
藉由排列人類和小鼠TF序列，故證明判定10H10物種特異性的抗原決定區殘基是發生在抗原決定區殘基中的顯著胺基酸差異：在人類TF中有24個殘基10H10接觸，人類和小鼠序列在位置68、69、70和104處不同；在N-域中，和序列識別號：1對序列識別號：3之C-域中位置136、142、145和197。該差異與適於小鼠TF之10H10的削弱後結合親和力一致。
圖2亦表示根據理論三維模型(圖3)為基礎，適於FVII和FX的人類TF上交互作用位置，描述其與三元複合體的關係(2003年Norledge等人發表於Proteins期刊53：640-648)。抗體5G9和TF結合在與FX結合位置部分重疊的抗原決定區。因此，5G9會與FX競爭，這將會導致凝血串聯的阻斷。10H10和5G9不同處在於其不會阻斷凝血，同時其有效切斷經由TF關聯PAR的訊息傳遞。根據三元TF/FVII/FX複合體模型得知，預期10H10抗原決定區將會為在TF自由表面上且位在圍繞殘基K149-D150中央處。藉由誘變所圖繪出10H10結合位置和胜肽抗原決定區圖譜比對，提供這種情況的早期證據。
目前介於TF ECD和10H10 Fab間的複合體晶體結構，提供一種空間圖譜比對，其中該抗體可結合到TF、但不會妨礙FVII和FX與TF，或其彼此間的交互作用。如該結構所顯示的10H10抗原決定區包含理論上存在於三元複合體內的TF之自由表面。此外，10H10抗原決定區會部分重疊到凝血阻斷MAb 5G9抗原決定區(1998年Huang發表於supra)，常見的殘留物為K149與N171。不論是10H10或5G9皆不會阻斷FVII與TF的結合。10H10和FX的抗原決定區也非重疊，但在目前模型中、Fab的恆定域和FX的蛋白酶(球狀)域間會出現立體衝突。然而應注意到FX方位事實上可能與模型不同，FX和TF間的關係可能讓蛋白酶域內還有些彈性。在Fab之可變區和恆定域間彎角處亦有相當彈性，可能會讓10H10結合到三元複合體後不會有衝突。實例3：為供人類之用而修改的結合域
治療性蛋白質的功效係可能因不必要的免疫反應而受到限制。非人類單株抗體可具有可能可引起人類免疫反應之實質延伸性的線性胺基酸序列和局部結構構象。將負責非人類mAb標靶結合之免疫特異性的殘基轉移到人類抗體，往往更支持不引起適於標靶抗原之結合親和力實質損失的結果。因此，使用合理設計原理來創造抗體分子是非常有價值的，在注入到人體內時引起的免疫反應最少，同時保留母代非人類分子的結合和生物物理外貌。
如前面在US20090118127A1內所述和2010年Fransson等人發表於J Mol Biol期刊398：214-231內所例示，使用一種2個步驟的製程來人類化和恢復或增強結合親和力，以產生結合到人類TF時顯現出鼠抗體10H10之標靶效應的本發明抗體物種。該種2個步驟的製程稱之為人類框架適應性(HFA)，包含1)人類框架選擇和2)親和力成熟步驟。
在HFA製程中，結合位置殘基(CDR)係與根據序列相似性和結構考量所選出的人類生殖細胞系基因。適於抗體的2種CDR分配系統為：根據抗體序列變異性的Kabat定義和根據抗體三維結構分析的Chothia定義。在6個CDR之中，當有分歧時可使用一種或其他系統。在輕鏈CDR的情況下，使用Kabat定義。
在重鏈CDR3的情況下，Kabat和Chothia的定義是完全相同。在重鏈CDR1的情況下，Chothia的定義係用來定義開始而Kabat的定義則為終止(W、接續著疏水性胺基酸如V、I或A所定義的模式)。在VH-CDR2的情況下，使用Kabat定義。然而，在多數抗體結構中，這項序列基礎定義會將FR3部分分配成屬於CDR2。因此，亦可使用這個CDR的較短版本，終止於這個CDR之C-端區域上的7個殘基，如本文中稱之為Kabat-7。人類FR的選擇
定義成V區內、不含抗原結合位置之區域的人類FR，其係選自於功能人類生殖細胞系IGHV和IGHJ基因的基因譜。人類生殖細胞系基因序列的基因譜係藉由搜尋IMGT資料庫(Lefranc 2005)並編譯所有的「01」等位基因而獲得。從這個編譯，將冗餘基因(胺基酸水平為100%相同)和未成對半胱氨酸殘基者從編譯中移除掉。該項基因編譯最近於2007年10月1日完成更新。
適於VH之HFA的人類序列初步選擇，係根據人類VH生殖細胞系基因對應於小鼠VH區域總長度的序列相似性，包含FR-1至3以及為H-CDR-1和H-CDR-2。在下一階段中，使用將CDR長度、小鼠和人類序列之CDR間的序列相似性兩者列入考量的評分，為所選出的人類序列排序。標準突變矩陣，例如BLOSUM 62取代矩陣(1992年Henikoff發表於Proc Natl Acad Sci USA期刊15；89(22)：10915-9)，係使用於小鼠和人類序列之CDR排列的評分，且如果在CDR循環中有插入和/或刪除時，即造成很大損失。人類FR-4係根據IGHJ生殖細胞系基因(Lefranc 2005)與小鼠10H10序列、IGHJ4(如序列識別號：60)之序列相似性而選出。
使用一個類似步驟來選出VL的人類FR。在這種情況下，使用IGHV基因使用以外其他相同步驟所選出的IGVK、生殖細胞系基因，當作適於選擇FR的1-3和L-CDR 1-3的基因。人類IGJ-K2基因(序列識別號：61)係選定為所有變異體的FR4。
選出11個VH和7個VL生殖細胞系鏈。所選出的VH基因主要來自IGVH-1基因家族：6個序列來自帶有IGVH1-69的IGVH1和使用著較長暨較短之H-CDR2的IGVH1-f，2個來自IGVH3，以及一個使用著長暨短之H-CDR2的IGVH5基因CDR2。VL基因代表6個IGVK2和1個IGVK4基因家族。
因此，具有較長之H-CDR2(序列識別號：7)的VH變異體H15、H19和H21，分別對應於使用較短小鼠CDR-H2(如序列識別號：27)的H22、H23和H24。前綴「S」表示測試變異體在β鏈區域中帶有較少小鼠殘基而帶有較多人類殘基。所使用的V-區指定和所使用的基因序列係如以下表2和表3所示。

代表著11個重鏈和7個輕鏈之人類FR變異體，加上鼠10H10嵌合鏈的96個MAb資料庫，係表現於96孔盤形式中的HEK 293E細胞內，以提供初分篩的上清液。為了進行初步篩選，故使用標準重組方法將編碼選定可變區的DNA重組，以形成瞬間表現在HEK 293E細胞內之96孔盤中的完整MAb。轉染後96個小時針對來自於培養基的上清液流體進行活性測試活性(結合)。
19個變異體係選出來應用於HEK 293-F細胞中的實驗性規模表現，然後根據初分篩的結果來進行純化。實驗性規模表現係瞬間即在750毫升體積的HEK 293F細胞或CHO-S內完成。讓收穫之上清液透過蛋白質A層析法進行純化，接著針對純化後之蛋白質進行其親和力和功能活性評估。此外，讓純化後之蛋白質受到藉由SDS-PAGE、SE-HPLC和交互作用層析法(CIC)的生物物理特性化。同時計算出每個變異體的理論等電點(pI)。自實驗性規模特性化，一系列最終重要的候選者在WAVE生物反應器內進行轉染，然後透過蛋白質A進行純化。結合評估
母代嵌合抗體、M1和HFA變異體與人類和馬來猴TF的結合，係使用化學發光偵測，依照直接ELISA形式來實施。為了初步篩選原始上清液內的資料庫變異體，故讓試樣或對照組在花費FreeStyle 293 HEK介質(Gibco公司)中正規化成50奈克/毫升，然後在單一濃度測定下進行分析。在本實驗中，抗體的濃度為5奈克(使用0.1毫升)，而TF ECD和抗原為His6-TF-ECD_1-219、最終濃度為10奈克/孔時使用。
整個組合資料庫的篩選結果表示除H14外，所有其他VH以不同強度結合到hTF。有幾個HFA變異體提供的結合信號高於母代10H10(H13，L1)，特別是一些L3和L5組合。H18和H21不會結合到人類抗原、也不會結合到其他VH，顯示對馬來猴抗原的結合不足。在VL之間，L6和L8在其他結合處於可偵測水平時也不會與任一抗原結合。H14和L8在與任何VL結合時也產生較低的表現。77個抗體(VH，VL組合)中有50個呈現如表4所示的TF結合。
使用ELISA、根據適於TF的相對結合親和力，選出10個變異體來進行大規模表現和純化。藉由BIAcore所測得的K_Ds摘要、ELISA分析數據、全細胞結合、藉由50 nM FVIIa、2微克/毫升Mab而從MDA-MB231細胞所誘發的IL-8抑制作用和依照Thermoflour分析所測得的TMS係如表5所示。

幾個新的人類mAb變異體展現出對TF較高的親和性，相對於M1來說(具有10H10可變鏈：H13和L1)，一些則較低。適於M61(0.21 nM)的K_D值低於鼠母代MAb(K_D=0.56 nM)2.5倍。表5中的數據包括4個包含H15和4個帶有H22，兩者皆架構自相同生殖細胞系基因(IGHV5-a)的Mab。那些帶有H22和較短H-CDR2者，通常比帶有H15之對應分子具有較高的結合親和力。雖然許多屬於馬來TF所結合的新變異體，但是馬來猴結合親和力的排序與適於與人類TF結合者不同。
小鼠10H10 mAb的Tm為74.2℃。所選分子的Tm範圍介於75至82.2℃。因此，HFA製程會創造出帶有適於人類和非人類靈長類動物TF之結合親和力增加之新Fd區域的抗體構造，且亦產生帶有人類域的穩定完整抗體變異體。
額外的新抗體構造之特性化驗證該抗體能夠認出源自人類腫瘤組織之細胞(MDA-MB231乳腺癌衍生細胞)上的天然TF，並在藉由抑制來自MDA-MB231的IL-8誘發所測得之VIIa存在下而減少TF訊息傳遞。
額外的生物物理特性化(溶解度和交互作用層析法)和分析結果，導致選出適於親和力成熟之可變區H22和L3所組成的M59。實例4：抗體成熟
如美國專利案第6,472,147號(Scripps)和帶有限制酶位置之輕微修正例的申請人共同申請中之申請案WO2009/085462所述，Fab資料庫係架構在pIX噬菌體呈現系統中。
根據與hTF複合體中之10H10實驗性結構得知，將2個資料庫設計成從M59配對的H116(序列識別號：19)和L3(序列識別號：23)開始，以達到V_L和V_H兩者的多樣性。該資料庫因多樣性而在所標靶位置上不同，也在用來多樣化標靶位置的胺基酸中不同。一個資料庫多樣化成總共有8個代表各CDR的位置，先前顯示要與TF接觸。這項設計重點放在L1、L3、H1和H2。在L2中接觸的位置係未多樣化，H3中的多數位置亦然。避免，例如半胱氨酸和蛋氨酸，不穩定或反應性胺基酸。
將第二套資料庫設計成讓位在抗原結合位置周圍的胺基酸多樣化，而抗原結合位置係藉由計算結合和非結合之Fab晶體結構的溶劑可存取性所判定。因為結合所埋掉、但還是與溶劑分子接觸的殘基，係因多樣性而成為標靶。總共有12個殘基(6個在V_L內且6個在V_H內)係使用這種方法判定，其係多樣化成帶有8種胺基酸還原組，包含：Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Gly(G)、His(H)、Ser(S)、Trp(W)和Tyr(Y)。組合的資料庫規模估計為8₁₂或10₁₀變異，其等可使用標準資料庫限制選殖技術而被適用。
針對CDR接觸殘基資料庫來說，該位置係使用核苷酸二聚體(N-二聚體)合成法來多樣化成帶有15種胺基酸(Met、Cys、Lys、Gln和Glu除外)。
噬菌體塗佈蛋白質IX上所呈現的Fab資料庫係根據相關領域已知的篩選計畫、對生物素化hT-ECD進行篩選，藉由選出較低離開速率(離開速率值增加)或較快結合速率(結合速率值減少)、或同時使用來導向親和性增加。篩選用在人類和馬來猴TF、作為標靶抗原。噬菌體係藉由輔助噬菌體感染而產生。結合劑係藉由SA-珠的添加，以形成珠/抗原/噬菌體複合體而回收。最後一次清洗後，噬菌體係因倍增生長之TG-1大腸桿菌細胞的感染而救出。噬菌體係再次產生，然後進行額外的篩選回合。
pIX基因係以NheI/SpeI消化而從選定殖株摘除，自我黏合後，讓DNA轉化到TG-1細胞內並在LB/瓊脂板上過夜生長。過夜培養基係用在(i)針對V-區的菌落PCR和測序，及(ii)可溶性Fab生產。可溶性Fab蛋白質係藉由多株抗-Fd(CH1)抗體而抓到板上。經過適當清洗和阻斷後，添加濃度為0.2 nM的生物素化hTF，然後利用HRP共軛鏈黴抗生物素蛋白和如前的化學發光讀值來偵測生物素化hTF。這種濃度的hTF能夠讓Fab變異體排序，依照母代的結合百分比而定，其中出現在所有板中當作對照組的母代Fab係定義成百分百結合。
依照這個準則，選出相對於M59 Fab為100%以上的381個Fab結合人類TF。
針對選定殖株的分析成功顯示出對應於V-區(序列識別號：4或19)之27和30-32處的重鏈CDR1(序列識別號：6)之Y2、I5、T6和Y7處有著顯著變化。雖然沒有接觸殘基，但位置27處僅允許一個芳香族胺基酸(Tyr和Phe)。針對與在10H10 Fab中、人類TF序列識別號：1之K68、T101、Y103和L104(圖1)直接接觸的位置30-32來說，位置30是相對寬鬆，但位置31和32則受到限制(表6)。
在L-CDR2變化中，對應於序列識別號：4或19之位置L52、S55和S57的L3、S6和S8(序列識別號：7)中，其為與在10H10 Fab中、人類TF序列識別號：1之P194、S195型和T197(圖1)直接接觸的殘基，所允許的取代會受到一定限制。
在H-CDR3中，對應於序列識別號：4或19之N104的位置N6(序列識別號：8)，其讓直接與人類TF-ED(序列識別號：1)之F147、G148和K149直接接觸受到限制。
使用0.2 nM之人類TF-ECD1-219，藉由噬菌體篩選和固相捕獲法分析篩選相容結合親和力所選定的各個資料庫位置中之許可胺基酸變化如表6所示。
針對選定殖株中的VL來說，對應於LC可變區(序列識別號：5或23)之位置32、33、34和36的L-CDR1(序列識別號：9)之S9、G10、N11和K13中的變化，其係藉由抗原決定區圖譜比對到人類TF序列識別號：1之接觸E174、D129、S142、R144和D145(圖1)所示，如表7所示為相對寬鬆。針對L-CDR2來說，序列識別號：5或23中的殘基W1，位置56(Kabat殘基編號50)是一種接觸殘基，而殘基E61顯示取代容忍度受到限制。在對應於序列識別號：5或23之殘基位置97-100的輕鏈CDR3(序列識別號：9)中，其有與人類TF序列識別號：1之K149、D150、N171號和T172直接接觸(圖1)，位置D97(Kabat位置91)係受到限制。根據與人類TF-ECD1-219殖株許可胺基酸使用結合之親和力的選擇係匯總於表7中。

總之，一系列親和力改善過之Fab變異體的識別，係透過噬菌體資料庫的構造，而該噬菌體資料庫係根據帶有適於可變區H22(序列識別號：19)和L3(序列識別號：23)之抗原人類TF的接觸位置中，胺基酸之CDR位置的直接雜色，接著藉由在與起始序列比對時篩選出相容或較佳結合之分析中，篩選並選擇出帶有親和力的物種。
整體而言，獲得選自於所設計之HFA資料庫之VH和VL配對的親和力之適度增加。然而，從接觸殘基雜色的VH資料庫，在嚴格噬菌體篩選後重新選出母代胺基酸。從結構分析解釋得知僅有兩個抗體結合部位位置顯著改變。這兩種胺基酸取代係在親和力成熟期間介入CDR中，T31P和S57F為涉及的接觸殘基。親和力改善5倍係可歸因於F57與TF之S195接觸界面增加。VL與TF的相互作用似乎是易受到影響的，讓接觸殘基、還有周邊殘基都有許多變化。
381個VH和VL配對的43個係被選擇用於進一步特性化。選定的43個MAb代表27個不同的VH和8個VL(見表8的重鏈和輕鏈序列配對)，且可分類成3個亞組：第1組的變異體有相同輕鏈(L3，序列識別號：23)，第2組和3組係以配對著2種不同重鏈(分別為H116和H171，序列識別號：131和67)的8個輕鏈為代表

屬於27個具有與M59(L3，序列識別號：23)相同的輕鏈之抗體的群組，該等27個重鏈在H-CDR1(GYTFX₁X₂X₃WIE(序列識別號：83)中的3個位置不同，其中X1係選自於A、D、G、I、L、N、P、R、S、T、V、Y，而X2係選自於A、P、S、T和X3係選自於F、H和Y)；除了在H189之外，其中，H-CDR1為GFTFITYWIA(序列識別號：81)，且在H-CDR2(DIX₁PGX₂GX₃TX₄(序列識別號：107)中4個位置，其中，X1係選自於I和L，X2係選自於S和T，X3係選自於A、F、H和w；以及X4係選自於D、H、I、L和N；除了在H189之外，其中，H-CDR2為DILPASSSTN(序列識別號：105)，而H-CDR3和FRs同於H22序列(序列識別號：19)且為SGYYGNSGFAY(序列識別號：8)。用於這些27個Mabs之重鏈的獨特組成如下(表9)。
H171(序列識別號：139)與H116相較之下，包含H-CDR1和H-CDR2中的額外變化，即為I31A和S55T。
兩個Mab群組係以配對著2個不同HC：H22(序列識別號：19)或重鏈H171(序列識別號：139)其中一者的8個LC(表10)代表。這8個輕鏈均具有L3的FR(衍生自IGKV240_O1)且具有在L-CDR1(KSSQSLLX₁X₂X₃X₄QX₅NYLT(序列識別號：116)中5個位置，其中的X1係選自於F、P、S、T、W和Y；X2係選自於F、S、T、R和V；X3係選自於A、G、P、S、W、Y和V；X4係選自於G、N和T；X5係選自於K、R和S)、在L-CDR 2(X₁ASTRX₂S(序列識別號：120)中2個位置，其中，X1係選自於H和W；X2係選自於D、E和S)和在L-CDR3(QNDX₁X₂X₃PX₄T(序列識別號：128)中4個位置，其中，X1係選自於D、F和L；X2係選自於S、T和Y；其中，X3係選自於W和Y；X4係選自於L和M)的序列變化。這8個LC的組成係被顯示於表10中。

這些Mabs的一些受到進一步特性化且在體內異種移植模式內被測試(實例5)。實例5：MAB特性化
遵照以包含著單一LC可變區(L3，序列識別號：23)和單一HC可變區(H22，序列識別號：19)之M59為基礎之變異體資料庫，配合CDR殘基中部分改變過之殘基的人類框架適應性和重新選擇，故讓新型mAb接受生物物理和生物活性分析，而配有改變過之抗體結合部位殘基的一對M1587係用來重新檢查原先具有適於10H10Fab結合到TF-ECD(實例2)特性的抗原決定區是否有改變。人類TF ECD：M1587界面
以10H10 CDR，帶有TF ECD之M1587(L3和H116)為基礎的人類適應性和親和力成熟之抗體，其共結晶係依照針對10H10(實例3)同樣方式進行，不同處為M1587-Fab：TF複合體係從含有16% PEG 3350、0.2 M醋酸銨、0.1 M醋酸鈉、pH 4.5的溶液結晶而成。
人類TF ECD與帶有親和力成熟之M1587Fab者之共晶結構比較結果表示10H10的人類適應性和親和力成熟對於抗體抗原決定區足跡並無改變，如圖2所示，亦無改變過之CDR的構象。在人類框架適應性和親和力成熟期間將3個胺基酸置換(T31P、S57F和N59T)導入H-CDR1和H-CDR2中(分別為序列識別號：6和27，使用實例2所述的CDR定義)(序列識別號：6和7係以序列識別號：63和86置換)，包含位在H116(序列識別號：133)之殘基31和57處的接觸殘基為T31P和S57F。親和力改善5倍係可歸因於F57與TF之S195接觸的界面增加。帶有M1587Fab的人類TF ECD結構證實HFA和親和力成熟期間即使改變H-CDR1和H-CDR2抗體結合部位殘基，仍保存抗原決定區。生物物理和生物檢定結果
這些抗體的匯總數據係如下所示：藉由Biacore所得的KD分析(表11)，人類TF所引起的人血漿凝血時間(表12)，因FVIIa刺激而來自MD-MB-231細胞之IL-8釋放適用的EC50(表13、14和圖5)。
針對43個經選擇的親和力成熟之mAb(M1)的K_D值，鼠10H10和帶有選定人類框架適應性變異體，CDR未從10H10改變過(M數小於100)的Mab嵌合版本所產生的數據係被顯示於表11中。因此，人類框架選擇和CDR殘基置換的組合即產生人體抗體的K_D介於80至950pM時，離開速率(Koff)介於2.2×10-5秒-1至2.6×10-3秒-1；結合速率介於10⁴ M-1秒-1至2.3×10⁵ M-1秒-1。比對原始鼠10H10或嵌合結構數值，新型mAb的平衡解離常數(K_D)低達10倍之多，從0.77 nM降低至0.08 nM；顯示出更快的結合速率(K_on>10⁵ M-1秒-1)或更慢的離開速率(Koff=10⁵秒-1)。這些特性係可用於用來針對想要停留時間或滲透組織能力的特定應用選出Mab。
凝血
新型mAb特點是在體外測得有鈣和外源添加人類TF存在時，能夠結合到人類TF，但不會阻斷人血漿的凝血(表12)。針對17個HFA(M號小於100)變異體和38個親和性成熟變異體(M1583及以上)進行分析，然後報告T_½ Max(達到最大光密度50%時所需的秒數)。
所有顯示反應類似於帶有10H10者所觀察到的、T_½ Max小於205秒(表12)，表示這些抗體在與不帶有抗體、為159±17(n=14)的媒介物對照組比對下、不會延長凝血時間。如前所述之人類TF結合抗體(US7605235 B2)且衍生自阻斷FX結合到TF之鼠抗體5G9的CNTO860，其在相同分析中會延長凝固，但從未在1800秒內達到凝血。如實例4所述之43個具有改變過之CDR的其中5個MAb，係未在凝血檢定中被測試，因為其起始濃度低於2毫克/毫升。將多個測試的M1、M59和CNTO860值予以平均。
信號阻斷活性
新型mAb係亦如描述般、能夠阻斷透過TF/FVIIa複合體的訊息傳遞。乳腺癌細胞的TF/VIIa/PAR2訊息傳遞會誘導廣泛指令的血管生成因子，例如VEGF25、Cyr61、VEGF-C、CTGF、CXCL1和IL-8。以前報導過FVIIa會誘導MDA-MB-231，人類乳腺癌細胞表現TF中可偵測的IL-8(2007年Albrektsen等人發表於J Thromb Haemost期刊5：1588-1597)。因此，這項檢定係當作生物檢定使用，藉以評估變異體抗體對於抑制TF/VIIa誘發之IL-8產生的活性。
如本文上述所提供之分析細節，以及測試19個實例3之HFA(M10-M68)變異體和29個實例4之CDR變異體結果，係針對單一濃度TF(每毫升0.5毫克)時測試抑制IL-8生產的活性。不會結合到組織因子的一抗-RSV抗體(B37)係用來作為陰性對照組。在此濃度時，許多mAb的HFA能夠阻斷IL-8誘發超過67%(表13)。圖5顯示出比照10H10(分別為序列識別號：6和7)者，因27個共享L3輕鏈(序列識別號：23)且在H-CDR1或H-CDR2中有置換之MAb所造成的IL-8釋放之相對抑制作用。此外，將其中4個：M1584、M1611、F7M1612和TF7M1607與M一起放在完整滴定IL-8誘發分析中。所計算出的相對IC50更支持親和力改善過之變異體比10H10小的鼠-人類嵌合體M1更有力論點(表14)。實例4中所描述的親和力成熟抗體的其他親和力成熟群組產生類似結果。
實例6：抗體抗腫瘤活性帶有MDA-MB-231的小鼠異種移植模式
將MDA-MB-231人類乳腺癌細胞培養在含有10%FBS和1%LNN的DMEM培養基中，於對數增殖期時以胰蛋白酶消化作用來收穫，且以5×10⁷個細胞/毫升濃度被再懸浮於無菌無血清DMEM培養基中。從Charles River實驗室獲得20隻雌性SCID Beige(CB-17/IcrCrl-scid-bgBR)小鼠，實驗前先進行14天馴化。約8周齡時，在小鼠右腋下乳腺脂肪墊處植入2.5×10⁶個MDA-MB-231細胞。當腫瘤為大約100立方毫米時，將小鼠依照腫瘤大小分層為治療群組(每個群組N=10)以Dulbecco磷酸鹽緩衝液(DPBS)或M1593，在10毫克/體重公斤下，從分層日開始進行腹膜內治療，然後持續每週一次，總共進行6次。每週紀錄一次腫瘤和體重。當各組的平均腫瘤體積達到1500立方毫米時，研究終止。所應用的統計檢定為二因子重複測量變異數分析ANOVA(GraphPad的4.0 PRIZM)。
在MDA-MB-231異種移植模式中，M1593在第22天起會顯著抑制腫瘤生長(^＊ P<0.01)，持續到第29天(^＊＊ P<0.001)，在這時候讓對照組(DPBS處理過)安樂死。M1593治療組則在第36日安樂死。M1593在第29天抑制腫瘤生長大約49%。相對於DPBS處理過的對照組來說，M1593治療組中讓腫瘤延遲生長大約11天(圖6)。帶有A431的小鼠異種移植模式
將A431人類鱗狀癌細胞培養在含有10%FBS和1%LNN的DMEM培養基中，於對數增殖期時以胰蛋白酶消化作用來收穫，且以1×10⁷個細胞/毫升濃度被再懸浮於無菌HBSS中。從Charles River實驗室獲得20隻雌性SCID Beige(CB-17/IcrCrl-scid-bgBR)小鼠，實驗前先進行14天馴化。大約8周齡時，在小鼠右腋下乳腺脂肪墊處植入2×10⁶個A431細胞。當腫瘤為大約118立方毫米時，將小鼠依照腫瘤大小分層為治療群組(每個群組N=10)。以DPBS或M1593，在10毫克/體重公斤下，從分層日開始進行腹膜內治療，然後持續每週一次、總共進行6次。每週紀錄二次腫瘤和體重。當各組的平均腫瘤體積達到1000立方毫米時，研究終止。所應用的統計檢定為二因子重複測量變異數分析ANOVA(GraphPad的4.0 PRIZM)。
M1593在第22天起會顯著抑制腫瘤生長(^＊ p=0.0067)，在這時候讓對照組(DPBS處理過)安樂死。CNTO592治療組則在第39日安樂死。CNTO592在第22天抑制腫瘤生長大約54%。相對於DPBS處理過的對照組來說，M1593治療組中讓腫瘤延遲生長大約17天(圖7)。實例7：具改變過之Fc的抗體組成
自然發生的人類Fc受體變異體具有與人類抗體FC-部分實質上不同的親和力。此外，臨床研究已經證明在以Fc工程過之mAb治療後，改善帶有緊密結合Fc基因型之患者的反應率和生存期(2008年Musolino等人發表於J Clin Oncol期刊26：1789-1796(2008)；2009年Bibeau等人發表於J Clin Oncol期刊27：1122-1129)。
雖然預期TF訊息傳遞的抑制作用會降低細胞反應、導致腫瘤細胞增殖、移動和轉移性蔓延，不過事實顯示TF抗原係呈現在腫瘤細胞上，提供藉由抗體Fc所接合之Fc受體相關機制，選擇性殺死標靶細胞的手段。已知FC-域抗體的表面特徵是受到聚糖組成以及重鏈的一級序列的影響，而任一者或兩者的修改例係可改變FC-受體結合。
鑑定為M1593的MAb係產生為低海藻糖聚糖改性IgG1，亦可為IgG1-1CH2域變異體(S239D，I332E，其中編號屬於Kabat EU系統)。 MAb的組成和製作方法
具低海藻糖含量的抗體(M1593-LF)的製作如以下所示，藉由電穿孔載體來讓M1593(IgG1/Kappa)鏈編碼而將信號胜肽編碼到針對來自CHO宿主細胞株的蛋白質藻岩醣化而選出的CHO宿主細胞亞株之中。序列識別號：165代表包含可變區、殘基1-113(序列識別號：23加上FR4，序列識別號：61，底線)和人類Kappa恆定輕域的完整輕鏈。包含著帶有野生型人類抗體同型CH1、CH2和CH3之可變區殘基1-120(包含序列識別號：139和FR4序列識別號：60，底線)的重鏈，其中Kabat位置239和332(為序列識別號：167的242和335)，係分別從野生型殘基S和D、到D和E修正而來，以形成變異體M1593-DE。 M1593-輕鏈
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLSSGNQKNYLTWYLQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQNDYTYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(序列識別號：165)
M1593-重鏈，其中Kabat位置S239為D、而I332為E
EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYTFAPYWIEWVRQMPGKGLEWMGDILPGTGFTTYSPSFQGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARSGYYGNSGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP D VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP E EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(序列識別號：167)
經過4回合陰性外源凝集素的選擇(選擇不會與海藻糖結合外源凝集素產生結合者)和FACS排序後，藉由亞選植來產生CHO細胞，以便隔離出一池當作宿主細胞使用的自然發生低海藻糖細胞。該細胞株係衍生自用來製造M1593的相同宿主細胞，因此細胞的培養和處理正是以同樣方式進行。使用適於偵測和揀選到96孔盤內之細胞株的的G蛋白質，藉由甲基纖維素平板化法來進行轉染細胞的篩選。將培養基擴散到滴定用的震盪器燒瓶。頂母代殖株在批次震盪燒瓶培養基中產生出的M1593-LF高達708毫克/公升(在標準介質中)。
針對2種M1593-LF生產殖株(C2452B和C2452D)進行LC-MS醣肽圖譜比對，以確定岩藻醣化百分比並評估糖化輪廓隨著時間和生產製程的穩定性(表15)。試樣係在穩定性研究期間，從第1代進料批次到第10批次培養基收集而來，然後予以純化。亦分析從生物反應器評估的純化後試樣。醣肽圖譜比對顯示來自C2452B和C2452D的總岩藻醣化百分比低時，這樣的醣化模式較有利。重要的是，岩藻醣化百分比隨著時間不會有顯著增加，表示宿主細胞的岩藻醣化作用是穩定的。因此針對M1593-LF的海藻糖含量低於10%，且通常低於5%，而在一些製劑中則不到2%。非外源凝集素選定之宿主CHO細胞中所產生的Mab，其包含超過80%皆已海藻糖化的聚糖基團。
為了M1593之FC變異體(M1593-DE)的突變，因此讓質粒表現M1593受到定點突變作用。生物活性
3種抗-人類TF FC變異體(M1593、M1593-LF和M1593-DE)傾向於人類和馬來猴Fc受體(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)兩者。如申請人申請中的專利申請案(美國編號61/426619)所述，或藉由表面等離子共振儀(Biacore)基礎的結合分析，來實施這些分析。
這些分析結果顯示，兩種Fc修正過之抗TF抗體對重組人類FcγIIIa受體，與母代未修正過之IgG1的M1593抗體相較之下，結合更加緊密，為18倍(M1593-LF)和40倍(M1593-DE)(表16)。

ADCC係受到FcγRIIIa接合的刺激。ADCC分析係如前所述般實施(2007年Scallon等人發表於Mol Immunol期刊44：1524-1534)。
使用人類PBMC當作效應物細胞而人類乳腺癌細胞株當作標靶細胞，進行體外ADCC分析，即可反應出改善過之Fc受體結合的功能(圖8)。
圖1顯示出由10H10 Fab(抗原結合片段)或與一種人類適應性變異體(M1593 Fab)和人類的TF-ECD殘基5-208之共晶體的X光繞射分析所揭示的抗原決定區，其中在M1593 H-CDR1(T31P)和HCDR-2(S57F)中改變過的兩種接觸殘基如圖所示。
圖2是一種人類(序列識別號：1,1-219)、cyno(序列識別號：2,1-220)和小鼠TF-ECD(序列識別號：3,1-221)殘基的胺基酸排列，該圖顯示出經由鼠抗體TF8-5G9(1998年Huang等人發表於J Mol Biol期刊275：873至94)以及10H10所接觸的殘基位置，和那些已知欲與凝血因子FVII/VIIa和FX接觸的殘基。
圖3顯示出人類TF-EC的三維投影，具標示著經由5G9和10H10的抗體結合部位、還有凝血因子FVII和FX所接觸的區域，其中僅有殘基L104和T197係經由10H10和FX二者而被接觸。
圖4顯示出一種小鼠抗體10H10(序列識別號：分別是4和5)重鏈(上層排列)和輕鏈(下層排列)可變區的胺基酸序列排列、抗體M59(序列識別號：分別是19和23)的人類框架適應性序列，和兩種經選擇的親和力成熟之可變區序列H116(序列識別號：133)和H171(序列識別號：139)。
圖5顯示出抑制作用相對百分比，其為比照同型對照組B37下、27種親和力成熟之單株抗體(mAb)針對來自MDB-MB-231乳腺癌細胞、濃度為0.24微克/毫升的FVIIa-誘導IL-8釋放。
圖6顯示出將MDA-MB231腫瘤細胞植入免疫功能低下小鼠體內數天後的腫瘤體積圖表，其中該給予M1593的群組顯示腫瘤增長減緩。
圖7顯示出將A431人類鱗狀腫瘤細胞植入免疫功能低下小鼠體內數天後的腫瘤體積圖表，其中該給予M1593的群組顯示腫瘤增長減緩。
圖8顯示出，由人類PBMC對應於MAb濃度所構成的標靶細胞分解(MDA-MB231細胞)百分比圖表，其中MAb濃度分別適於鼠可變區-人類IgG1(M1)、位置234和235以丙氨酸取代的鼠可變區-人類IgG4、當作未修正過膽固醇(CHO)內所產生之野生型IgG1的M1593、為了產生出具低海藻糖含量之聚糖而選定之CHO株內所產生的M1593-LF和在S239D和I332E以Kabat取代的M1593-DE。
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<130> CEN5309WOPCT
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<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
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<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
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<212> PRT
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<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<220>
<221> 誘變
<222> (3)..(3)
<223> Xaa選自I及L
<220>
<221> 誘變
<222> (6)..(6)
<223> Xaa選自S及T
<220>
<221> 誘變
<222> (8)..(8)
<223> Xaa選自A,F,H及W
<220>
<221> 誘變
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<212> PRT
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<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 111
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 112
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 113
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
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<210> 116
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<212> PRT
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<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<220>
<221> 誘變
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<220>
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<220>
<221> 誘變
<222> (10)..(10)
<223> Xaa選自A,G,P,S,W,Y及V
<220>
<221> 誘變
<222> (11)..(11)
<223> Xaa選自G,N及T
<220>
<221> 誘變
<222> (13)..(13)
<223> Xaa選自K,R及S
<400> 116
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 117
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 118
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 119
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<220>
<221> 誘變
<222> (1)..(1)
<223> Xaa選自H及W
<220>
<221> 誘變
<222> (6)..(6)
<223> Xaa選自D,E及S
<400> 120
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 121
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 122
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 123
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 124
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 125
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 126
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 127
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<220>
<221> 誘變
<222> (4)..(4)
<223> Xaa選自D,F及L
<220>
<221> 誘變
<222> (5)..(5)
<223> Xaa選自S,T及Y
<220>
<221> 誘變
<222> (6)..(6)
<223> Xaa選自W及Y
<220>
<221> 誘變
<222> (8)..(8)
<223> Xaa選自L及M
<400> 128
<210> 129
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 129
<210> 130
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 130
<210> 131
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 131
<210> 132
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 132
<210> 133
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 133
<210> 134
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 134
<210> 135
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 135
<210> 136
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 136
<210> 137
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 137
<210> 138
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 138
<210> 139
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 139
<210> 140
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 140
<210> 141
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 141
<210> 142
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 142
<210> 143
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 143
<210> 144
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 144
<210> 145
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 145
<210> 146
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 146
<210> 147
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 147
<210> 148
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 148
<210> 149
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 149
<210> 150
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 150
<210> 151
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 151
<210> 152
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 152
<210> 153
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 153
<210> 154
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 154
<210> 155
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 155
<210> 156
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 156
<210> 157
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 157
<210> 158
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 158
<210> 159
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 159
<210> 160
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 160
<210> 161
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 161
<210> 162
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 162
<210> 163
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 163
<210> 164
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 164
<210> 165
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 165
<210> 166
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 166
<210> 167
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於人類IgG可變域框架之鼠類CDR或其誘變
<400> 167

权利要求:
Claims (31)
[1] 一種經單離之抗體，該抗體和鼠抗體10H10競爭結合至人類組織因子，其中該抗體結合域適合於結構為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3的一人類框架(FR)區，其中該FR胺基酸序列係未受到人類生殖細胞系基因序列所編碼之胺基酸序列改變，而該生殖細胞系係為IMGT資料庫所辨識且該CDR序列帶有與序列識別號：6-11和27所代表之小鼠10H10 CDR不少於50%的序列相同度。
[2] 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體並不和FVIIa競爭結合組織因子，且並實質上不阻斷TF-VIIa複合體的前凝血劑、醯胺水解活性，但會阻斷以MDA-MB-231細胞釋放之細胞介素IL-8所檢測的TF-VIIa調解訊息傳遞。
[3] 如申請專利範圍第2項之抗體，其中一或多種該等CDR序列係選自於序列識別號：6-11和27的序列。
[4] 如申請專利範圍第3項之抗體，其中該等三種輕鏈CDR序列L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3係分別以序列識別號：9-11代表。
[5] 如申請專利範圍第3項之抗體，其中該等三種重鏈CDR序列H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3係分別以序列識別號：6-8或分別以序列識別號：6、27和8代表。
[6] 如申請專利範圍第3項之抗體，其中L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3係分別以序列識別號：9-11代表，而該等三種重鏈CDR序列H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3係分別以序列識別號：6-8或分別以序列識別號：6、27和8代表。
[7] 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該人類HC可變區框架係衍生自以IMGT資料庫所代表的一IGHV家族1、3或5成員。
[8] 如申請專利範圍第7項之抗體，該抗體包含選自於序列識別號：12-21的一HC可變區。
[9] 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該人類LC可變區框架係衍生自一人類IGKV家族2或4成員。
[10] 如申請專利範圍第9項之抗體，該抗體包含選自於序列識別號：22-26的一LC可變區。
[11] 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該人類HC可變區框架係衍生自選自於IGHV5和IGKV2之一人類生殖細胞系基因家族。
[12] 如申請專利範圍第1項之抗體，該抗體包含選自於序列識別號：12-21的一HC可變區和選自於序列識別號：22-26的一人類LC可變區。
[13] 如申請專利範圍第1項之抗體，該抗體包含具有序列識別號：8之H-CDR3的一HC可變區；具有選自於序列識別號：6、62-83之一序列的一H-CDR1；具有選自於序列識別號：7、27和84-107之一序列的一H-CDR2；和選擇性選自於IGVJ4(序列識別號：60)之一HC FR4區，或其之一變異體。
[14] 如申請專利範圍第1項之抗體，其包含一LC可變區，該LC可變區具有選自於序列識別號：9、108-116之一序列的L-CDR1；選自於序列識別號：10和117-120之一序列的L-CDR2；選自於序列識別號：11和121-128之一序列的L-CDR3；及選擇性選自於IGKJ2(序列識別號：61)之一LC FR4區，或其之一變異體。
[15] 如申請專利範圍第1項之抗體，其包含一HC可變區以及一LC可變區和一選擇性LC FR4區，該HC可變區具有序列識別號：8之該H-CDR3；一具有選自於序列識別號：6、62-83之一序列的H-CDR1；一具有選自於序列識別號：7、27和84-107之一序列的H-CDR2；和一選擇性選自於IGVJ4(序列識別號：60)之HC FR4區，或一其之變異體，以及該LC可變區具有一具有選自於序列識別號：9、108-116之一序列的L-CDR1；一具有選自於序列識別號：10和117-120之一序列的L-CDR2；以及一具有選自於序列識別號：11和121-128之一序列的L-CDR3；和該LC FR4區選擇性選自於IGKJ2(序列識別號：61)，或其之變異體。
[16] 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該HC人類框架序列係衍生自IGHV5_a且該HC可變區具有選自於序列識別號：19、129-155的該序列。
[17] 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該LC人類FR序列係衍生自IGKV2D40_O1，且該LC可變區具有選自於序列識別號：23、157-164的序列。
[18] 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該HC人類框架序列係衍生自IGHV5_a，且該HC可變區具有選自於序列識別號：19、129-155所的該序列，該LC人類FR序列係衍生自IGKV2D40_O1，且該LC可變區具有選自於序列識別號：23、157-164的序列。
[19] 如申請專利範圍第1項之抗體，該抗體具有衍生自定義成非CDR位置之IGHV5_a框架的一結合域、一具有序列SGYYGNSGFAY(序列識別號：8)的H-CDR3且，其中在該H-CDR-1和/或H-CDR-2位置的序列可以用下列分子式表示：H-CDR1 GYTFX₁X₂X₃WIE (I)(序列識別號：83)其中，X1係選自於A、D、G、I、L、N、P、R、S、T、V和Y；X2係選自於A、P、S和T；而X3係選自於F、H和Y；或該序列可為GFTFITYWIA(序列識別號：81)；以及H-CDR2 DIX₁PGX₂GX₃TX₄ (II)(序列識別號：107)其中，X1係選自於I和L，X2係選自於S和T，X3係選自於A、F、H和w；而X4係選自於D、H、I、L和N；或，其中，H-CDR2為DILPASSSTN(序列識別號：105)。
[20] 如申請專利範圍第1項之抗體，該抗體具有一結合域，其中該非CDR位置係衍生自IGKV2D40_O1框架且，其中該等位在L-CDR-1和/或L-CDR-2以及L-CDR-3的序列具有以下列分子式表示的序列：L-CDR1 KSSQSLLX₁X₂X₃ X₄Q X₅NYLT (III)(序列識別號：116)其中，X1係選自於F、P、S、T、W和Y；X2係選自於F、S、T、R和V；X3係選自於A、G、P、S、W、Y和V；X4係選自於G、N和T；和X5係選自於K、R和S；L-CDR2 X₁ASTRX₂S (IV)(序列識別號：120)其中，X1係選自於H和W；X2係選自於D、E和S；L-CDR3 QNDX₁X₂X₃PX₄T (V)(序列識別號：128)其中，X1係選自於D、F和L；X2係選自於S、T和Y；其中，X3係選自於W和Y；而X4係選自於L和M。
[21] 一種治療一人類主體的方法，該人類主體罹患一種症狀，其中TF表現以及由該TF表現所產生的局部生物活性係直接或間接與該欲治療的症狀有關，該方法包含將如專利申請範圍第1、3、19或20項之抗體施予此一需要此治療之主體。
[22] 如申請專利範圍第21項之方法，其中該症狀為癌症。
[23] 如申請專利範圍第22項之方法，其中該癌症係選自於原發性固體型腫瘤、轉移癌；癌、腺癌、黑色素瘤、液體型腫瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、軟組織癌、肉瘤、骨肉瘤、胸腺瘤、淋巴肉瘤、纖維肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪瘤、神經膠母細胞瘤、星細胞肉瘤、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、膽道癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、肺癌、腎臟癌或膀胱癌。
[24] 如申請專利範圍第21項之方法，其中該症狀係選自於良性瘤、血管瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、砂眼以及化膿性肉芽腫；動脈硬化斑；眼部血管新生疾病、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變、黃斑點退化、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼、晶狀體後纖維組織增生、虹膜發紅、視網膜母細胞瘤、眼睛的眼色素層炎和翼狀贅肉(異常血管生長)；風濕性關節炎；牛皮癬；傷口癒合延遲；子宮內膜異位；脈管發生；肉芽；肥厚性疤痕(瘢痕瘤)；未癒合性骨折；硬皮病；砂眼；血管附著；心肌血管生成；冠狀動脈側枝；腦絡；動靜脈畸形；缺血性肢體血管新生；遺傳性出血性血管擴張症(Osler-Webber Syndrome)；斑部新生血管；微血管擴張症；血友病性關節；血管纖維瘤；纖維肌肉發育不良；傷口肉芽；克隆氏症和動脈粥狀硬化。
[25] 一種用於治療一主體的醫藥組成物，其包含種如專利申請範圍第1、3、19或20項之抗體於一藥學上可接受的製劑內。
[26] 一種套組，其包含以一穩定形式之如專利申請範圍第1、3、19或20項之抗體和使用說明。
[27] 一種經單離之核酸，其編碼一或多種如專利申請範圍第1、3、19或20項之抗體的抗體結合域。
[28] 一種載體，其包含至少一種如專利申請範圍第27項之多核苷酸。
[29] 一種宿主細胞，其包含如專利申請範圍第28項之載體。
[30] 如申請專利範圍第1、3、19或20項之經單離抗體或片段，其具有一IgG1或IgG4同型。
[31] 如申請專利範圍第30項之經單離抗體或片段，其中該Fc域包含人類IgG1同型，其中該等Kabat位置239和332(序列識別號：167的242和335)係，在Fc區中，從野生型殘基S和D修飾成D和E突變。

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